以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种以Argonaute内切核酸酶为核心的 简单的高效的精确的靶向基因编辑技术。
【背景技术】
[0002] 深入了解遗传信息以及进行基因治疗需要精确和有效的基因组编辑工具。基因或 基因组编辑是一种基因工程技术。该技术通过核酸酶对基因组的特定位点进行突变、插入、 置换等改造。基因编辑的过程包括三步:首先，经过特别设计的向导DNA或RNA(基因导向元 件)与核酸内切酶(基因切割元件)结合，前者引导后者到靶向基因的特定区域;其次，核酸 内切酶对靶向基因的特定区域进行切割，在两条DNA上各形成一个缺口，造成双链断裂 (DSB);最后，利用DSB激活细胞内固有的修复机制这一现象，在修复缺口的同时可以进行突 变、插入、置换等改造。大部分物种细胞对DSB有两种修复机制：
[0003] nonhomologous end-joining(NHEJ)和homologous directed repair(HDR)〇NHEJ 利用一系列酶反应将DNA断裂端直接重新连接;HDR需要一段同源序列作为修复模板对DSB 后失去的DNA序列进行复原。NHEJ是一种带有错误倾向性的低保真修复途径，它在修复过程 中往往带入突变。而HDR需要同源模板进行修复，于是可利用这一性质将外源的编码序列插 入基因组的靶向位点。HDR机制类似于同源重组，但因为HDR是基于DSB的修复，其引入外源 序列的成功率较同源重组高三个数量级。因此，这两种修复途径的特性成为了核酸酶高效 基因编辑的基础，对诱导的断裂区进行改造性修复。基因编辑技术对深入了解基因功能、改 变基因以及基因治疗有着革命性的意义。
[0004] 目前，应用于基因组编辑的核酸酶包括四个家族：Zinc finger nucleases (ZFNs)'Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALENs)、the engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases和CRISPR/Cas9system〇前三者或者 对革巴向序列有特殊要求、或者针对祀向序列需要对酶本身个体化特定设计、或者有高脱革巴 可能，所以应用受到限制。CRISPR/Cas9是目前比较推崇的基因编辑系统。Cas9源自细菌，它 以向导RNA为引导，理论上可对基因组中的任何在靠近PAM序列上游的靶点进行切割造成 DSB。然而，因为RNA较易形成二级结构，因此对GC丰富的基因序列，Cas9系统效率低下。并 且，因为细胞自身产生大量RNA片段，Cas9有与这些非特异RNA结合被错误引导切割非靶向 基因组位点的可能性;而且Cas9对向导RNA和靶向DNA序列错配的耐受较高(5个核苷酸错配 不会阻止切割），所以Cas9有一定的脱靶缺陷。
[0005] Argonautes是一种核酸酶，其普遍存在于细菌、植物、真菌、哺乳细胞内。 Argonaute广为人们所知的是其参与RNA干扰机制，大部分物种的Argonaute与短链非编码 RNA相结合，后者作为向导RNA通过互补反应识别革E1向mRNA，引导Argonaute降解mRNA，或阻 止翻译进程达到抑制基因翻译的效果。近来发现从细菌Thermusthermophilus获取的 Argonaute (TtAgo)能够结合单链DNA并以后者为向导降解DNA质粒。这一现象提示某些物种 的Argonaute可作为DNA核酸内切酶。TtAgo自身因为酶切反应需要较高的温度(>65°C)而不 适于用作基因编辑工具。本发明中，我们公开了来自于一种细菌的Argonaute，其在37°C具 有很好的酶切活性适用于作为基因编辑的工具。该蛋白用5'磷酸化的单链DNA作为向导 DNA，对哺乳动物细胞的基因定点切割造成DSB。该Argonaute系统高效精准，向导DNA设计简 单，能有效地将外源基因片段导入切割区。其不受GC序列和PAM序列的限制，能针对基因组 的任何序列进行编辑，并且忠实度高。是较CRISPR/Cas9更为有效的基因编辑工具。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种新型的以Argonaute核酸酶为主体的以短链DNA作为向 导的高保真基因编辑工具。其可被用于但不限于DNA体外编辑、细胞内DNA编辑、基因组基因 灭活、外源片段插入基因组。
[0007]本发明公开了 一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法，10-50°C以5 '端磷 酸化的单链向导DNA为向导，Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合，对与该向导DNA互补的 革巴向DNA进行切割，造成革E1向DNA双链断裂。所述的Argonaute核酸酶为能以5'端磷酸化的单 链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
[0008] 本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后，通过细胞自身的低保真Non-Homologous End Joining修复途径，引入突变，从而造成革El向基因或功能区灭活或改变。
[0009] 本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后，在存在具有同源序列的外源DNA片段情况 下，能够通过细胞自身的Homologous Directed Repair修复途径将该外源DNA片段插入双 链断裂区，从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
[0010] 本发明的特点在于1、向导单链DNA设计简单，除5 '磷酸化24个核苷酸长外无特殊 序列或二级结构要求;2、对靶序列无特殊序列要求，靶序列富含GC不影响其切割效率，因此 可编辑基因组的任何位置;3、因为哺乳动物细胞内罕有5'磷酸化的单链DNA，所以基本不存 在被其它非向导DNA误导脱靶的可能;4、高特异低脱靶性，向导DNA与靶序列间1个碱基对的 错配就会造成切割效率大大下降;3个碱基对的错配会造成切割活性的丧失;5、因为向导是 DNA，因此转染细胞简单而且剂量可控。
【附图说明】
[0011 ] 图1: (a)靶质粒、靶切割位点和向导DNA的设计图。（b)靶质粒pACYCDuet-GFP与细 胞来源经过纯化的NgAgo蛋白以及向导DNA分别孵育4小时和8小时。随后电泳分析质粒。4小 时时部分质粒还处于完整的超螺旋结构，部分单链断裂成开环结构，部分双链断裂成线性 DNA』小时时反应完全，所有质粒均被双链切割。（c)靶质粒被NgAgo双链切割后靶位点测序 的部分结果。结果显示靶位点被定向切割并有部分序列被移除。
[0012]图2: (a)靶质粒、靶切割位点、向导DNA和向导RNA的设计图。（b)部分Hela细胞共转 染了 EGFP-N1靶质粒、NgAgo表达载体和标注的向导DNA;部分细胞共转染了靶质粒、Cas9表 达载体和标注的向导RNAaGFP蛋白的表达通过Western blot来检测。本Western电泳图是三 次独立实验的代表图，其相应半定量结果显示在左下方柱形图。右下方柱形图显示了NgAgo 系统和Cas9系统改变GFP蛋白表达的统计结果（林叶〈0.01)。（〇)用恥48〇的三种同源酶 HpAgo、NaAgo和NtAgo分别重复上述实验，结合向导DNA后，此三种Argonaute均可有效的革巴 向抑制靶蛋白GFP的表达。
[0013] 图3: (a)选取的两个靶位点分别是人基因组里HBA2和GATA4基因的高GC含量序列。 分别设计了针对这两个序列的向导DNA(G37和640)^13)2931 1细胞转染了NgAgo表达载体和 向导DNA，一些细胞转染了 Cas9表达载体和靶向于同一区域的向导RNA。随后用T7核酸内切 酶KT7EI)检测法检测基因组里的靶位点被编辑的效率。可以看见NgAgo系统对高GC含量的 靶向区编辑效率较Cas9系统要高得多。
[0014] 图4: (a)NgAgo系统对哺乳动物基因组连续多途径编辑实验模式图。RFP-TGA-GFP 供体DNA由以下序列组成：一个报告基因区和一个抗G418选择基因，后者由自带的CMV启动 子引导具有表达功能。前者报告基因区由一个红色荧光蛋白（RFP)基因和一个绿色荧光蛋 白（GFP)基因组成。二者由TGA转录终结子分隔。该供体DNA两端由两段人DYRK1A基因同源序 列构成。如果该供体DNA按正确读码框插入基因组的靶向位置，RFP和G418选择基因会表达 而GFP因为TGA的存在而不表达。（b) 293T细胞共转染了NgAgo表达载体、针对DYRK1A基因靶 向区的向导DNA和RFP-TGA-GFP供体DNA。3天后，细胞的靶向区用PCR扩增，发现供体DNA准确 的插入靶向区域。（c)通过G418选择两周后，绝大部分细胞表达RFP。这些细胞又被转染 NgAgo表达载体和针对TGA转录