一种提取鱼类肠道微生物基因组dna的高温复合法
【技术领域】
[0001]本发明涉及提取鱼类肠道微生物基因组方法，具体说，是一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法。
【背景技术】
[0002 ]提取微生物基因组DNA的方法包括试剂盒法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、溶菌酶法、物理法(如超声波法、液氮研磨法、珠磨法)等。市场上提取微生物基因组DNA的试剂盒种类较多，大多针对哺乳动物、土壤环境或直接提取单一菌种基因组DNA，对鱼类肠道微生物特异性差;所得到的DNA片段小、得率低，且价格十分昂贵。
[0003]CTAB法具有良好的去除腐殖酸和其他环境杂质的功能，但只利用化学方法破壁，有破壁是否完全的顾虑;溶菌酶可有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，对革兰氏阳性菌裂解比较完全;而革兰氏阴性菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶并不能完全裂解革兰氏阴性菌细胞壁。而物理方法破壁虽然效率高，但需要摸索各种条件，包括功率、次数、时间等，强度小就不能完全破壁;强度高会使DNA断裂甚至降解。目前提取动物肠道微生物基因组DNA应用的方法都比较单一，没有兼顾革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌以及其他一些种类微生物。此外，在已有试验方法中，溶菌酶和RNase A都是在37°C温度下工作，而组织和细胞中DNA酶等裂解酶在此温度下最活跃，会造成DNA大量降解。由于鱼类生活环境的特殊性，其肠道微生物种类组成复杂，易受外界环境因素的影响，已有方法对鱼类肠道微生物基因组DNA提取效果较差，鉴定出的菌种很难真实反映鱼类肠道微生物的组成结构。
[0004]所以提取鱼类肠道微生物基因组DNA需要将物理和化学方法进行有机结合，优势互补，对鱼类肠道各种微生物进行破壁，又要控制化学试剂与样品的孵育温度来最大程度地避免组织和细胞中DNA酶的降解作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对鱼类肠道微生物特点，提供一种高效、经济、适用于提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，先超声波法后溶菌酶法，使鱼类肠道各类群微生物破壁，超声波物理破壁的条件为150-250?，超声2-3s，间隔5s，循环50-60次，将超声波处理后的样品与溶菌酶在55-65°C温度的水浴恒温振荡器中共同孵育30min，与RNase A共同孵育的温度为27-32°C。
[0007]具体地说，包括以下步骤:
[0008](1)取健康鱼肠道，无菌棉线结扎肠两端，无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、月旨肪，挤压出肠道内含物，将肠道纵向剖开，刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，将肠道壁剪成段；将肠内含物、黏膜及肠道壁碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s;随后4°C，800r/min，离心5min，取上清;4°C，5000r/min离心5min ；弃上清，加入1.5m 1 PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液；
[0009](2)将含有1.5ml菌液的2ml离心管插入装有碎冰的烧杯内，使超声波细胞破碎仪变幅杆置于菌液中，在150-250?条件下，超声2-3s，间隔5s，循环50-60次，以破裂微生物细胞，随后将菌液在4°C，10000-14000r/min，离心5min，收集沉淀；
[0010](3)向沉淀中加入50μ1的20mg/ml溶菌酶及750μ1的1 X ΤΕ缓冲液，移液枪反复轻柔吹打，重悬沉淀，在水浴恒温振荡器中，55-65°C条件下温育30min;冷却至室温，加入10μ1的20yg/ml RNase A，在水浴锅中27_32°C温育30min；加入ΙΟΟμΙ浓度为 100yg/ml的SDS、30μ1浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在65°C水浴恒温振荡器中往复式震荡2h;
[0011](4)加入lml苯酚-氯仿-异戊醇混合液，苯酚-氯仿-异戊醇混合液按体积比苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，颠倒混勾，在10000-140001'/111；[11条件下离心2111；[11，取80(^1上清，移至新的离心管；随后加入800μ1氯仿-异戊醇混合液，氯仿-异戊醇混合液按体积比氯仿:异戊醇= 24:1，颠倒混勾，在10000-14000r/min条件下离心5min，取600μ1上清，移至新的离心管；加入60μ1的3Μ NaAc和1.2ml在-20°C预冷的无水乙醇，置于_20°C冰箱中沉淀DNA30min ； 10000-14000r/min，离心 5min，收集沉淀；
[0012](5)用体积百分比浓度75 %乙醇洗涤沉淀2次，吸出剩余酒精，室温晾干，加入30-50μ1在50°C预热的1 X TE缓冲液，溶解DNA。
[0013]所述步骤(1)为取健康鱼，用体积百分比浓度的75%乙醇擦拭体表，用钝头剪刀自肛门向脊柱方向剪开体壁，避开腹腔内组织，剪刀头上挑，防止损伤组织，剪至鳃盖后缘后，再沿鳃盖后缘剪至下颂，掀开体壁;用眼科剪分离出肠道，无菌棉线结扎肠两端;无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、脂肪;挤压出肠道内含物，用眼科剪将肠道纵向剖开，随后用解剖刀刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，剩余肠道壁剪成段;将肠内含物、粘膜及肠碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s ；随后4°C，800r/min，离心5min，取上清;4°C，5000r/min离心5min;弃上清，加入1.5ml PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液。
[0014]所述步骤(2)中超声波破壁条件为:200W，超声2s，间隔5s，循环55次;所述步骤(3)中溶菌酶破壁孵育温度为60°C; RNaseA孵育温度为30°C。
[0015]所述1 XTE缓冲液为每100ml灭菌去离子水中含lml的1M Tris_HCl和0.2ml的0.5MEDTAo
[0016]本发明的有益效果是:步骤简便，操作简单，常规仪器即可完成。与进口试剂盒相比，虽耗时略久，但经济高效，且得到的基因组DNA更加完整、得率高；对鱼类肠道微生物特异性强、根据提取的DNA鉴定出的菌种可更加真实反映鱼类肠道微生物的组成结构，适用于各种后续试验。
【附图说明】
[0017]图1是利用高温复合法(超声波条件:200w，2s，间隔5s，循环55次；溶菌酶孵育温度:60°C ； RNase A孵育温度:30°C)提取的锦鲤肠道微生物基因组DNA电泳结果(M:Marker ；Η:锦鲤肠道微生物基因组DNA)。
[0018]图2是利用高温复合法(超声波条件:150w，3s，间隔5s，循环60次；溶菌酶孵育温度:55°C ； RNase A孵育温度:32°C)提取的锦鲤肠道微生物基因组DNA电泳结果(M:Marker ；J:锦鲤肠道微生物基因组DNA)。
[0019]图3是利用高温复合法(超声波条件:250w，2s，间隔5s，循环60次；溶菌酶孵育温度:65°C ； RNase A孵育温度:28°C)提取的半滑舌鳎肠道微生物基因组DNA电泳结果(Μ:Marker; S:半滑舌鳎肠道微生物基因组DNA)。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明，所述乙醇百分比均为体积百分比:
[0021]本发明提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，包括以下步骤:
[0022]1、取健康鱼，用75%乙醇擦拭体表。用钝头剪刀自肛门向脊柱方向剪开体壁，避开腹腔内组织，剪刀头上挑，防止损伤组织，剪至鳃盖后缘后，再沿鳃盖后缘剪至下颂，掀开体壁。用眼科剪分离出肠道，无菌棉线结扎肠两端。无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、脂肪等物质。
[0023]2、挤压出肠道内含物，用眼科剪将肠道纵向剖开，随后用解剖刀刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，剩余肠道壁剪成段;将肠内含物、粘膜及肠碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s。随后4°C，800r/min，离心5min，取上清。4°C，5000r/min离心5min。弃上清，加入1.5ml PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液。