方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品，显示更好的灵敏度。
[0051 ]实施例4特异性实验
用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的耐除草剂大豆DP-356043、Roundup ReadyGTS 40-3-2、A2704-12、A5547-127、DP56423、M0N89788、M0N87701、CV127，转基因玉米M0N810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花进行鉴定，照EU Reference Laboratory for GM Foodand Feed 中的引物356043 F: GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA(SEQ ID No:5),356043 R:TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCSEQ ID No: 6)和探针356043 Probe: FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRACSEQ ID No:7)进行荧光定量PCR 检验。
[0052]请参阅图5，鉴定结果显示:转基因大豆Roundup Ready GTS 40-3-2、A2704_12、八5547-127、0?305423、]\?^89788、]\?^87701、(^127，转基因玉米顯嫩10，转基因水稻^'63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花)反应管均为橙色、无“S”型扩增曲线(详见图5中的曲线2-曲线19)，即无扩增;转基因大豆M0N87701的反应管为绿色、显现“S”型扩增曲线(详见图5中的曲线1)，即有扩增。本结果与EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的焚光定量PCR 反应结果相一致，显示出良好的特异性。
[0053]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0054]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，其特征在于:包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示: 外引物1:CATAACCTCATCTCGCCTT(SEQ ID No:l)； 外引物2:CAATGGAATCCGAGGAGG(SEQ ID No:2)； 内引物1:AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC(SEQ ID No:3)； 内引物2:TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC(SEQ ID No:4)。2.耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分: (1)引物液:含有权利要求1所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测弓丨物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48?5 2μΜ外引物1、48?5 2μΜ外引物2，48?52μΜ内引物1、48?52μΜ内引物2; (2)反应液:含有12mM dNTPs、10 X Isothermal Amplif icat1n反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，所述dNTPs、反应缓冲液和MgS04水溶液的体积比是7?9:4?6:2; (3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的浓度为7?9UAU; (4)对照:阳性对照为耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。3.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述弓丨物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2。4.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的浓度为8υ/μ1。5.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述反应液中，12mM dNTP: 10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液:150mMMgS04水溶液的体积比为8:5:2。6.根据权利要求2?5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。7.根据权利要求2?5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYT0-9。8.利用如权利要求2?5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA; 2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶1μ1，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混勾后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min; 3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。9.利用如权利要求6所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA; 2)恒温检测反应:在200μ1 PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混勾后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min; 3)结果判断:在上述PCR管中加入1?2μ1显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。10.利用如权利要求7所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品 DNA; 2)恒温检测反应:在200μ1PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2 μΙ,?ΝΑ聚合酶Ιμ?，荧光指示剂SYTO-9 Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free DistilledWater补齐到25μ1 ；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min ； 3)结果判断:根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。
【专利摘要】本发明公开了耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法。LAMP检测引物组包括四条特异性引物；LAMP检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；LAMP试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检样品的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检样品是否含有耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、可以现场检测等优点，适于推广应用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483122
【申请号】CN201510705030
【发明人】方雪恩, 王欣珍, 孔凡树, 陈旭, 徐凌佳, 孔继烈
【申请人】上海速芯生物科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月27日