金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体t-7及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌产生中毒性休克毒素-l(toxic shock syndrome toxin-1，TSST_1)引发中毒性休克综合征(toxic shock syndrome，TSS)。中毒性休克综合征因多器官受累，以发烧、低血压、剥脱性发疹、腹泻、呕吐为主要特征，最终导致休克和多脏器衰竭，病死率高而倍受重视。国内已报道流行性腮腺炎、鼻腔术后、严重烧伤后和输液伴发金葡菌的感染或TSST-1的污染而发生毒性休克综合征。
[0003]TSST-1是由噬菌体I群金黄色葡萄球菌产生的外毒素，是一种多肽蛋白质，属于致热原性超抗原家族，具有很强的超抗原活性。TSST-1是一个由两个亚单位(A、B)紧密堆积而成的肾形分子，其A亚单位是毒素的活性中心，它决定毒素的致病性与作用方式，通过作用于细胞内的靶点而发挥细胞毒效应，B亚单位能与靶细胞上的特异性受体结合，它决定毒素对宿主细胞的选择亲合性。
[0004]TSST-1不经抗原提呈细胞处理，直接结合到细胞表面主要组织相容性复合物Π(ΜΗΟΠ )类分子抗原结合槽的外侧，这种结合是非限制性的，形成的复合物与T淋巴细胞抗原受体(TCR)的β链V区结合，激活T淋巴细胞使其活化、增殖，并释放大量的炎性细胞因子引起强烈的免疫应答，最终导致炎症失控和多器官的损害。
[0005]适配体(Aptamer)是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列(DNA或RNA)。对可结合的配体具有严格的识别能力和高度的亲和力，这是由于单链寡核苷酸的一些二级结构，如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为适配体与靶物质特定区域结合的基础，并且两者主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等相互作用力产生高效特异的结合力。因此，一个适配体可以区分密切相关亚型或不同的相同的分子构象状态。寡核苷酸适配体是由体外生成的化学合成，使之化学改性或添加荧光染料来控制其稳定性，以用于实验室诊断或临床治疗。适配体突出特点在于其作用靶点广泛、无免疫原性、宿主适应性好、组织渗透性强，因此是一种很有发展前途的药物分子，可用于直接干扰疾病的发生发展过程。由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能抑制蛋白的功能，而且它缺乏免疫原性，体内渗透力强，因此是一种很有发展前途的药物分子，可用于直接干扰疾病的发生发展过程。通过适配子与TSST-1特异性结合，并对其进行结构分析、序列改造及修饰优化，达到适配体抑制TSST-1功能的目的，临床应用前景广阔。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种高亲和力、高特异性的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7及其制备方法和应用。
[0007]本发明的目的通过如下技术方案实现:一种金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，该核酸适配体T-7的序列如下所示:
[0008]tgcgtgtgta gtgtgtctgt gggccaggtc cctattataa ataactctta gggatttggg 60
[0009]egg63
[0010]所述核酸适配体T-7的二级结构为茎环结构，其中茎多由G= C配对组成，并连接大小不一的环，其分子结构如图1所示。
[0011]所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的制备方法，通过下述方法制得:
[0012]采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以TSST-1为靶标，通过TSST-1羧基磁珠从ssDNA文库中筛选得到中毒性休克毒素-1适配体。
[0013]所述的ssDNA文库，两端为19nt的固定引物序列，中间25nt为随机序列:
[0014]5’-TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-N25-CTCTTAGGGATTTGGGCGG-3’。
[0015]经过8轮筛选，通过克隆测序及序列分析。
[0016]通过测定结合荧光强度，比较测序适配体与靶标的结合情况，发现所述适配体T-7具有较强结合力，并用荧光定量法分析适配体的亲和力及特异性。
[0017]所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，其特征在于:对核酸适配体T-7的5’-端或3’-端进行FAM、B1tin、氨基等化学修饰。
[0018]所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的应用，
[0019]1)所述金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7在制备金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1的纯化和检测试剂中的应用。
[0020]2)所述金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7在研制治疗金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1相关疾病的药物中的应用。
[0021]较之现有技术而言，本发明的优点在于:本发明通过SELEX方法筛选获得的核酸适配体T-7能高亲和力、高特异性地与TSST-1结合，其中Kd值为103.8nM，因此该核酸适配体T-7可作为抑制TSST-1活性的一种潜在的拮抗剂，并在金黄色葡萄球菌感染的治疗和诊断方面具有应用前景。
【附图说明】
[0022]图1为核酸适配体T-7的二级结构。
[0023]图2为核酸适配体T-7的特异性分析结果。
[0024]图3为核酸适配体T-7的亲和力检测结果。
[0025]图4为CCK-8法测定适配体T-7对TSST-1诱导的PBMC增殖活性的作用。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例对上述方案做进一步说明。但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0027]—种金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，该核酸适配体T-7的序列如下所示:
[0028]tgcgtgtgta gtgtgtctgt gggccaggtc cctattataa ataactctta gggatttggg 60
[0029]egg63
[0030]如图1所示:所述核酸适配体T-7的结构为:以茎环结构为基础，其中茎多由G= C配对组成，并连接大小不一的环。
[0031]所述金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的制备方法，通过下述方法制得:
[0032]采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以TSST-1为靶标，通过TSST-1羧基磁珠从ssDNA文库中筛选得到TSST-1的核酸适配体，具体制备方法如实施例1所示。
[0033]实施例1体外筛选中毒性休克毒素-1核酸适配体
[0034]1)取磁珠Dynabeads M_270Carboxylic Acid用NaOH溶液洗3次，再用ddifeO洗3次，加入预冷的H)C溶液于室温置摇床孵育30min，弃上清，用预冷的ddH20洗1遍。
[0035]2)用MES溶液将TSST-1稀释至60yg/100yL，等体积与活化的磁珠混匀，室温摇床孵育 IBOmiruTris 溶液(50mM)洗3遍。
[0036]3)结合TSST-1的磁珠在Tr is溶液中孵育15min，弃上清，重悬于储存液中待用。
[0037]4)体外合成单链DNA文库，两端为19nt的固定引物序列，中间25nt为随机序列:
[0038]5 ’ -TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-N25-CTCTTAGGGATTTGGGCGG-3 ’，库容量为 1015。引物P1:5 ’ -TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-3 ’，引物P2: 5 ’ -CCGCCCAAATCCCTAAGAG-3 ’，引物P3: 5 ’ -FAM-TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-3’，引物？4:5’^0-0^00^厶厶1^(:0^厶6厶6-3’。以上核酸序列均委托生物技术公司合成并经HPLC纯化。
[0039]5)用选择缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris.HCl,5mM KC1，ImM MgCl2)将随机ssDNA文库溶解于EP管，95°C变性5min，立即置于在0°C下冰浴lOmin。
[0040]6)将ssDNA与包被TSST-1的磁珠混匀，37°C摇床孵育lh，吸弃上清。
[0041]7)用洗涤选择缓冲液(lOOmM NaCl，50mM Tris.HCl，5mM KC1，ImM MgCl2，0.02g/LBSA)洗去未结合的ssDNA，加入ddH20，100°C加热5min，分离上清作为模板，以上下游引物P3和P4进行PCR扩增，上下游引物P3和P4的浓度为10μΜ:
[0042]8)取上清液作为模板，优化PCR条件，PCR反应条件为:95°C预变性5mi