脂肪酸去饱和酶家族成员fad4、fad5、fad5-2和fad6及它们的应用

文档序号:9722679阅读:1383来源:国知局
脂肪酸去饱和酶家族成员fad4、fad5、fad5-2和fad6及它们的应用
【专利说明】脂肪酸去饱和酶家族成员FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它们的 应用
[0001 ]本申请是以下申请的分案申请:申请日:2001年9月28日;【申请号】 200910209825.3;发明名称:同上。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2000年9月28日申请的美国临时申请序号60/236,303和2001年6月12 日申请的美国临时申请序号60/297,562的优先权,所述临时申请的完整内容特此通过引用 完整地结合到本文中。所述临时申请所引用的所有参考文献的完整内容也特此通过引用结 合到本文中,成为本申请的一部分。
[0004] 发明背景
[0005] 脂肪酸是具有长链碳氢侧链基团的羧酸,在许多生物过程中起主要作用。脂肪酸 在自然中很少是游离的,而是作为脂类的主要成分以酯化形式存在。脂类/脂肪酸是能量的 来源(如b_氧化),并且是加工生物学或生物化学信息不可缺少的细胞膜的组成部分。
[0006] 脂肪酸可以分为两类:饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,其中不饱和脂肪酸在顺式构 型内包含一个或多个碳双键。不包含脂肪酸由属于非血红素-铁酶家族的末端去饱和酶产 生。每种这样的酶都是电子转运系统的一部分,而电子转运系统包含两种其它蛋白,即细胞 色素 bdPNADH-细胞色素^还原酶。明确地说,所述酶催化脂肪酸分子中碳原子之间双键的 形成。人和其它哺乳动物体内催化不饱和脂肪酸中特定双键形成所需的这些去饱和酶的种 类有限。因此,人必须通过膳食摄取一些脂肪酸。所述必需脂肪酸有,例如,亚油酸(C18:2); 亚麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)。与此不同,昆虫和植物能够合成更多种类的不饱和脂 肪酸及它们的衍生物。
[0007] 长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA,22:6(4,7,10,13,16,19)) 是哺乳动物体内各种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需成分。例 如,脑磷脂中超过30%的脂肪酸是22:6(11-3)和20:4(11-6)。(〇3¥;1;'(^(1,]\^.等(1997) 八111.1.(:1丨11.灿廿.66 :10323-10413)。在视网膜中,0撤占感光细胞的感光部分杆外节段中总 脂肪酸超过60%。(6丨118如少.]\1.等(2000)?1(^.1^口丨(11^8.39:315-391)。临床研究已经显 示:DHA对于婴儿脑部的生长和发育以及维持成人正常脑功能是必需的(Martinetz,M. (1992)夂?6乜 &廿.120:3129-3138)。0拟对于涉及信号传导过程、视紫红质激活以及视杆细 胞和视锥发育的感光细胞功能也有显著影响(Giusto,N.M.等(2000)Prog.Lipid Res.39: 315-391)。此外,在如高血压、关节炎、动脉粥状硬化、压抑、血栓形成和癌症等疾病的治疗 中也发现DHA的一些积极效应(Horrocks,L.A.和Yeo,Y.K. (1999)Pharmacol .Res ·40:211-215)。因此,通过膳食适当供应脂肪酸对于人维持健康是重要的。对于婴儿、年纪小的儿童 和年长的公民来说,从膳食摄取足够这些脂肪酸尤其重要,因为他们在体内不能有效合成 这些脂肪酸,必须通过食物补充(3?6(^(^,4.4.(1999)1^?丨(^34 :31-33)。
[0008] 根据甲基端最后一个双键的位置,DHA是n-3系列的脂肪酸。它通过去饱和以及延 长的交替步骤合成。DHA的生物合成从18:3(9,12,15)开始,涉及Δ 6去饱和形成18:4(6,9, 12,15),然后延长到20:4(8,11,14,17),随后 Δ 5去饱和形成20:5(5,8,11,14,17)。此后,对 于所述生物合成存在一些争议。传统观点是20:5(5,8,11,14,17)延长成为22:5(7,10,13, 16,19),然后通过最后的&4去饱和转化成为22:6(4,7,10,13,16,19)(!1〇灯〇1^11,0·?· (1992)Prog.Lipid Res.31:163-194)。然而,Sprecher等最近提出DHA生物合成另一个可能 的途径,该途径不依赖于A 4去饱和酶,涉及两次连续的延长、一次△ 6去饱和以及一次通过 在过氧化物酶体中的限制性β-氧化缩短两个碳(Sprecher,H.等(1995) J. Lipid Res.36: 2471-2477;Sprecher,Η·等(1999)Lipids 34:S153-S156)〇
[0009] 由于DHA对人类健康的有益作用,因此DHA的生产是重要的。目前DHA的主要来源是 鱼和藻类的油。鱼油是该脂肪酸的主要和传统来源,但是,到销售时,通常发生了氧化。另外 油的供应极不稳定,并且由于鱼量缩减,其来源处于危险中,而藻类来源由于产量低和提取 的尚额费用而昂贵。
[0010] EPA和AA都是△ 5必需脂肪酸。它们形成人和动物的食物和饲料组成部分的一个独 特种类。EPA属于n-3系列,在酰基链中有五个双键,EPA在海洋食物中发现,在来自北大西洋 的富含脂肪的鱼中很丰富。AA属于n-6系列,带有四个双键。AA在ω-3位置缺少一个双键,这 赋予它与Ε Ρ Α不同的特性。从A Α生产的类二十烷酸有强烈的炎症和血小板凝集特性,而从 EPA生产的类二十烷酸有抗炎和抗血小板凝集特性。也可以从一些食物如肉、鱼和蛋获得 AA,但浓度较低。
[0011] γ-亚麻酸(GLA)是在哺乳动物中发现的另一种必需脂肪酸。GLA是超长链n-6脂肪 酸和各种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物体内,长链多不饱和脂肪酸的形成受到A 6去 饱和的速度限制。已经显示:许多生理学和病理学状况如衰老、应激、糖尿病、湿疹和一些感 染抑制A 6去饱和步骤。此外,GLA容易受到来自与某些疾病如癌症或炎症的氧化和快速细 胞分裂的催化。因此,在膳食中补充GLA能够降低这些疾病的风险。临床研究已经显示:在膳 食中补充GLA有效治疗一些病理状况,如变应性湿疹、经前综合征、糖尿病、高胆固醇血症以 及炎症和心血管疾病。
[0012] GLA的主要来源是植物油和微生物,植物如月见草(Oenothera biennis)、琉璃苣 (Borago officinalis L·)、红酯栗(Ribes nigrum),微生物如被抱霉属菌(Mortierella sp.)、毛霉菌属菌(Mucor sp.)和蓝细菌(Cyanobacteria)。然而,由于这些GLA来源的可得 性有巨大波动以及与提取过程有关的费用,因此这些GLA来源对于膳食补充不是理想的。
[0013] 发明简述
[0014] 脂肪酸的生物合成是植物和微生物的主要活动。然而,人合成必需脂肪酸如长链 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)的能力有限。长久以来,人们一直认为生物技术是在植物和微生 物中操作生产脂肪酸的过程的有效方法。它节省成本、可再生并且副效应小。因此,已经进 行大量的艰苦的努力,意图通过操作植物、动物和微生物细胞生产各种化合物,包括特殊脂 肪酸和药用多肽。因此,生物技术是以安全成本-效益方式生产不饱和脂肪酸、尤其是 LCPUFA的诱人途径,以从这些脂肪酸获取最大治疗价值。
[0015] 本发明基于(至少部分基于)发现编码新型去饱和酶的核酸分子家族。尤其是本发 明的发明人已经鉴定涉及长链多不饱和脂肪酸DHA(二十二碳六烯酸,22:6,n-3)和DPA(二 十二碳五烯酸,22:5,n-6)生物合成的Fad4( Δ 4去饱和酶)、Fad5和Fad5-2( Δ 5去饱和酶)以 及Fad6( Δ 6去饱和酶);更具体地说,Fad4使22:5(n-3)和22:4(n-6)去饱和,导致DHA和DPA; Fad5和Fad5-2使20:4(n-3)和20:3(n-6)去饱和,导致EPA和AA;以及Fad6去饱和酶 18:2(η- 6)和18:3(n-3),导致GLA( γ-亚麻酸)和SDA(十八碳四烯酸)。
[0016] 在一个实施方案中,本发明提供一种分离的核酸分子,所述核酸分子包括在SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7中陈述的核苷酸序列。在另一实施方案 中,本发明提供一种分离的核酸分子,该核酸分子编码一种多肽,该多肽包括SEQ ID N0:2、 4、6或8中陈述的氨基酸序列。
[0017] 在又一实施方案中,本发明提供分离的核酸分子,所述核酸分子包括与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7陈述的核苷酸序列基本相同(如70%相同) 的核苷酸序列。本发明还提供分离的核酸分子,所述核酸分子包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:7陈述的核苷酸序列的至少30个连续核苷酸。在另一实施 方案中,本发明提供分尚的核酸分子,所述核酸分子编码包括氨基酸序列的多肽,所述氨基 酸序列与SEQ ID N0:2、4、6或8陈述的氨基酸序列基本相同(如50%相同)。还提供核酸分 子,所述核酸分子编码具有SEQ ID N0:2、4、6或8陈述的氨基酸序列的多肽的等位基因变异 体。除编码全长多肽的分离核酸分子外,本发明还提供编码本发明所述全长多肽的片段(如 生物活性片段)(如包括SEQ ID N0: 2、4、6或8的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基的 片段)的核酸分子。在另外的其它实施方案中,本发明提供与本文所述的分离的核酸分子互 补、或在严格条件下杂交的核酸分子。
[0018] 在相关方面,本发明提供包括本文所述的分离的核酸分子(如编码去饱和酶的核 酸分子)的载体。还提供包括这样的载体的宿主细胞(如包括适于生产去饱和酶核酸分子和 多肽的载体的宿主细胞)。
[0019] 在再一方面,本发明提供分离的去饱和酶多肽和/或其生物活性片段。示范性的实 施方案提供包括SEQ ID N0:2、4、6或8陈述的氨基酸序列的多肽、包括与SEQ ID N0:2、4、6 或8陈述的氨基酸序列至少50%相同的氨基酸序列的多肽、由包括核苷酸序列的核酸分子 编码的多肽,其中所述核苷酸序列与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或SEQ ID NO: 7陈述的核苷酸序列至少70%相同。还提供本文所述全长多肽的片段(如包括SEQ ID NO:2、4、6或8陈述的序列的至少10个连续氨基酸残基的片段)以及具有SEQ ID NO:2、4、6或 8陈述的氨基酸序列的多肽的等位基因变异体。
[0020] 在一个实施方案中,去饱和酶多肽或其片段具有去饱和酶活性。在另一实施方案 中,去饱和酶多肽或其片段具有N-末端血红素结合基序,如在前端(front-end)去饱和酶中 发现的细胞色素 b5样结构域。在另一实施方案中,去饱和酶多肽或其片段具有在所有微粒 体去饱和酶中发现的至少两个、最好约三个连续的组氨酸残基,并且可选地具有去饱和酶 活性。在一个优选实施方案中,所述去饱和酶多肽或其片段具有约三个组氨酸基序。
[0021 ]包含所述去饱和酶基因的构建物可以用于包含任何表达系统的植物、动物和微生 物,以产生能够生产LCPUFA如0撤3?4^4、304和61^的细胞。用于表达本发明的去饱和酶的 植物的例子其中包括来自油料种子作物的植物和植物种子,例如亚麻(Linum sp.)、油菜籽 (Brassica sp·)、大豆(Glycine和Soja sp·)、向日葵(Helianthus sp·)、棉花(corron) (Gossypium sp·)、玉米(Zea mays)、撤榄(Olea sp·)、红花(Carthamus sp·)、可可 (Theobroma cacoa)和花生(Arachis sp.)〇
[0022]在一个相关方面,本发明提供使用细胞(如植物细胞、动物细胞和/或微生物细胞) 生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA)和不饱和脂肪酸生物合成途径中其它关键化合物的新型改 良方法,在所述细胞中已经操作所述不饱和脂肪酸生物合成途径,以便生产LCPUFA或其它 所需的不饱和脂肪酸化合物。
[0023]本发明所述新型改良方法包括在细胞中生产不饱和脂肪酸(如DHA)的方法,所述 细胞中含有已经操作的不饱和脂肪酸生物合成途径的至少一种脂肪酸去饱和酶,以便生产 不饱和脂肪酸(如以高水平生产)。例如,本发明提供在包含如上文所述的至少一种分离的 去饱和酶核酸分子(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)或其部分的细胞中生产不饱和脂肪酸 (如DHA)的方法,以便生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))。所述方法可以另外包括回收 所述LCPUFA的步骤。
[0024]在另一实施方案中,本发明提供生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))的方法,该 方法包括在一定条件下,使包含至少一种上文定义的去饱和酶靶分子的组合物与至少一种 如上文定义的分离的去饱和酶多肽(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)或其部分接触,从而 生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))。所述方法还可以包括回收所述LCPUFA的步骤。
[0025] 上文所述的核酸、蛋白和载体尤其可用于本发明的方法中。特别地,本发明提供增 强不饱和脂肪酸生产(如DHA生产)的方法,所述方法包括在一定条件下培养包含去饱和酶 核酸(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)的重组植物、动物和/或微生物,从而增强脂肪酸生 产。
[0026] 在另一实施方案中,本发明提供产生能够生产不饱和脂肪酸的细胞的方法。所述 方法包括将编码蛋白的分离的核酸分子引入细胞(如植物细胞),所述蛋白具有催化脂肪酸 分子中双键形成的活性。
[0027] 在又一实施方案中,本发明提供调节脂肪酸生产的方法,所述方法包括培养包含 分离的核酸分子的细胞,以便调节脂肪酸的生产,其中所述分离的核酸分子编码具有催化 双键形成的活性的多肽。
[0028] 在再一实施方案中,本发明包括组合物,所述组合物包含本文所述的不饱和脂肪 酸核酸或多肽。本发明的组合物还可以包含能够生产如上文所述脂肪酸的细胞,并且可选 地还包括药学上可接受的载体。
[0029] 在另一实施方案中,本发明的组合物在如动物饲料中用作食品添加剂,或用作保 健品(neutraceutical)。本发明的组合物也用于治疗患有疾病的患者,包括给予所述组合 物以便治疗患者。所述方法包括的疾病包括,例如,应激、糖尿病、癌症、炎症和心血管疾病。
[0030] 本发明的其它特征和益处将随后的详细描述和权利要求而变得显而易见。
[0031] 附图简述
[0032] 图1显示来自破囊壶菌属菌(Thraustochytrium sp.)的Fad4DNA序列和蛋白序列; (A)可读框的cDNA序列(SEQ ID N0:1);和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID N0:2)。
[0033] 图2显示来自破囊壶菌属菌的Fad5的DNA序列和蛋白序列;(A)可读框的cDNA序列 (SEQ ID N0:3);和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID N0:4)。
[0034] 图3显示来自破囊壶菌属菌的Fad4和Fad5蛋白序列(分别是SEQ ID N0:2和4)的比 较。垂直条指示氨基酸同一性。突出显示保守基序如细胞色素 b5血红素结合基序和组氨酸 丰富基序。两个箭头指示两个简并引物的结合位置。
[0035] 图4显示来自畸雌腐霉(Pythium irregulare)的Fad5_2的DNA序列和蛋白序列; (A)可读框的cDNA序列(SEQ ID N0:5);和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID N0:6)。
[0036] 图5显示来自畸雌腐霉的Fad6的DNA序列和蛋白序列;(A)可读框的cDNA序列(SEQ ID NO: 10);和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID NO: 11)。
[0037] 图6显示来自畸雌腐霉的Fad5-2和Fad6蛋白序列(分别是SEQ ID N0:6和8)的比 较。垂直条指示氨基酸同一性。突出显示保守基序如细胞色素 b5血红素结合基序和组氨酸 丰富基序。两个箭头指示两个简并引物的结合位置。
[0038]图7是来自表达Fad4的酵母菌株Invsc2的脂肪酸甲基酯(FAME)以及外源底物22:5 (n-3)的气相色谱(GC)分析。
[0039]图8是图7中新峰的FAME的气相色谱/质谱(MS)分析;(A)Fad4产物;(B)DHA(22:6, n-3)标准。
[0040] 图9是来自表达Fad4的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物22:4(n-6)的GC分析。
[0041 ]图 10是图9中新峰FAME的GC/MS分析;(A)Fad4产物;(B)DPA(22:5,n-6)标准。
[0042] 图11是来自表达Fad5的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物20:3(n-6)的GC分 析。
[0043]图 12是图 11 中新峰FAME的GC/MS分析;(A)Fad5产物;(B)AA(20:4-5,8,11,14)# 准。
[0044] 图13是来自表达Fad5_2的酵母菌株ΑΜΥ2α的FAME分别与外源底物18:1_9(上部分) 和18:1-11(下部分)的GC分析。
[0045] 图14是来自表达Fad6的酵母菌株Invsc2的FAME与外源底物18:2(9,12)的6(:分析。
[0046]图15是图14中新峰的衍生物的MS分析。显示所述新脂肪酸的二乙基酰胺的结构, 其中m/z值代表包括酰胺部分的离子。在m/zl56/168、196/208和236/248的三对离子分别鉴 定为在Δ 6、Δ 9和Δ 12位置的双键。
[0047] 图16是来自在35S启动子控制下表达Fad4的芥菜(Brassica juncea)的叶的FAME 以及外源提供的底物22:5(n-3)的GC分析。
[0048]图17显示在35S启动子控制下表达Fad5_2的一个转基因 T1系的营养组织(叶、茎和 根)的脂肪酸组成。脂肪酸水平显示为芥菜总脂肪酸的重量百分比。
[0049] 图18是表达Fad5-2的芥菜的根FAME以及外源底物高γ -亚麻酸(11〇111〇-丫- linolenic acid,HGLA,20:3-8,11,14)的GC分析。
[0050]图19是从在napin启动子控制下表达Fad5-2的芥菜的种子制备的FAME的GC分析。 [00511图20是来自表达Fad6的芥菜的种子FAME的GC分析。三个新峰指出在转基因种子中 有三种△ 6去饱和脂肪酸。
[0052]图21显示在芥菜的Fad6转基因种子中积累的GLA( γ -亚麻酸)和SDA(十八碳四烯 酸)的重量百分比。
[0053]图22显示来自五个转基因系的种子脂类的脂肪酸组成,所述五个转基因系表达 Fad6; SA =硬脂酸;0Α =油酸;LA =亚油酸;GLA= γ -亚麻酸;ALA = a-亚麻酸;SDA =十八碳 四稀酸。
[0054]图23是一个表,显示破囊壶菌属菌的脂肪酸分布。
[0055]图24是一个表,显示畸雌腐霉的脂肪酸分布。
[0056] 图25是一个表,显示外源脂肪酸在酵母AMY-2a/pFad5-2中的转化。
[0057] 图26是一个表,显示在nap in (Napin)和亚麻种子特异性(Cln)启动子控制下表达 Fad5-2的转基因亚麻籽中Δ 5-不饱和聚甲烯中断的脂肪酸(Δ 5-UPIFA)的积累。脂肪酸水 平显示为总脂肪酸的重量百分比。
[0058] 图27是一个表,显示在napin启动子控制下表达Fad6的转基因亚麻籽(Solin和 Normandy)中△ 6去饱和脂肪酸的积累。脂肪酸水平显示为总脂肪酸的重量百分比。
[0059] 发明详述
[0060] 本发明基于(至少部分基于)脂肪酸去饱和酶家族新成员的发现,所述新成员在本 文中称为"去饱和酶"核酸和蛋白分子(如Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad-6)。这些新分子是脂肪 酸去饱和酶家族的成员,在生产LCPUFA的生物中表达,所述生产LCPUFA的生物例如破囊壶 菌属、畸雌腐霉、Schizichytriun^PCrythecodinium。
[0061] 本文所用术语"脂肪酸"是本领域内公知的,包括基于长碳氢链的羧酸。脂肪酸是 许多脂类(包括甘油酯)的成分。最常见的天然脂肪酸是具有偶数碳原子(16或18)并且饱和 或不饱和的单羧酸。"不饱和"脂肪酸在碳原子之间包含顺式双键。本发明包括的不饱和脂 肪酸包括,例如,DHA、GL
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