Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在制备家蚕microRNA超量表达系统中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在制备家蚕 microRNA超量表达系统中的应用。
【背景技术】
[0002] 家蚕(silkworm，Bombyx mori)是一种具有重要经济价值和科学研究价值的鳞翅 目昆虫。随着家蚕基因组的解析，对家蚕的研究已经进入功能基因组时代。miRNA技术是常 用的功能基因研究的技术之一，目前miRNA常用的方法是体外注射人工合成的miRNA模拟物 或通过转基因载体来体内高效表达家蚕miRNA，但是体外注射人工合成的miRNA模拟物，成 本高、期效短;而通过转基因载体来高效表达家蚕miRNA却又受到表达载体的局限，其原因 是目前大多数商业化miRNA表达载体适用于哺乳动物细胞，却不适合于miRNA在昆虫细胞中 的表达。
[0003] 因此，急需一种适用于家蚕的miRNA表达系统，能够在家蚕个体或细胞中高效表达 外源基因，为家蚕miRNA的功能研究提供了新的工具。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在制备家蚕 microRNA超量表达系统中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在制备家蚕mi croRNA超量表达系统中的应用。
[0007] 本发明中，所述家蚕microRNA超量表达系统含有重组pFastBacl载体，所述重组 pFastBacl载体由pFastBacl载体多克隆酶切位点处依次插入红色荧光蛋白编码基因和表 达家蚕microRNA的次级前体序列而得。
[0008] 优选的，所述重组pFastBacl载体由pFastBacl载体的EcoR I和Spe I处插入红色 荧光蛋白编码基因，并于Xba I和Κρη I酶切位点插入表达家蚕microRNA的次级前体序列而 得。
[0009] 更优选的，所述红色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0010] 更优选的，所述表达家蚕microRNA的次级前体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、 SEQID Ν0· 2或SEQ ID Ν0· 3所示。
[0011] 本发明中，所述重组pFastBacl载体由以下方法制备：克隆红色焚光蛋白编码基 因，然后插入pFastBacl载体多克隆酶切位点处，获得重组载体Red-pFastBacl;再克隆表达 家蚕microRNA的次级前体序列，然后再插入重组载体Red-pFastBacl的红色焚光蛋白编码 基因下游，得家蚕microRNA的超量表达系统。
[0012] 优选的，所述红色荧光蛋白编码基因插入pFastBacl载体的EcoR I和Spe I酶切位 点处;所述表达家蚕microRNA的次级前体序列插入pFastBacl载体的Xba I和Κρη I酶切位 点处。
[0013]本发明的有益效果在于：本发明通过以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统作为家蚕 microRNA的超量表达系统，该表达系统能够超量表达家蚕簇microRNAs，其中以家蚕let-7 簇miRNAs为例，实现了外源基因的高效表达，克服了体外注射人工合成的miRNA模拟物，成 本高、期效短的缺陷，同时克服了转基因载体不适合于昆虫细胞的缺陷，并为家蚕miRNA的 功能研究提供了新的工具。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015] 图 1 为家蚕pri-let-7、pri-miR-100、pri-miR-2795和let-7-C PCR扩增结果（A: pri-let-7 扩增结果;B:pri-miR-100 扩增结果;C:pri-miR-2795 扩增结果;D:let-7-C 扩增 结果）。
[0016] 图2为重组报告基因载体构建（A:Rp-let-7、Rp-miR-100重组质粒和Red-pFastBacl报告基因载体双酶切验证，其中泳道l~5分别表示Rp-let-7重组质粒、Rp-miR-100重组质粒、Rp-let-7重组质粒双酶切、Rp-miR-100重组质粒双酶切、Red-pFastBacl质粒 双酶切;B: Rp-miR-2795重组质粒双酶切验证，其中泳道1和2分别表示Rp-miR-2795重组质 粒、Rp-miR-2795重组质粒双酶切;C:Rp-let-7-C重组质粒双酶切验证，其中泳道1和2分别 表示Rp-let-7-C重组质粒、Rp-let-7-C重组质粒双酶切）。
[0017] 图3为miRNA的重组杆状病毒表达载体的构建(A:Red-pFastBacl载体与目的基因 连接后载体结构示意图；B:重组后基因结构示意图；C:Rp-let-7重组后PCR检测结果;D:Rp-miR-100E重组后PCR检测结果;F: RP-miR-2795重组后PCR检测结果;A:RP-let-7-C重组后 PCR检测结果）。
[0018] 图4为重组杆状病毒上清液感染Sf 9细胞后Red报告基因信号检测(A:未处理的Sf9 细胞系(WT);B:阴性对照AcNPV感染Sf9细胞系；C-F:重组杆状病毒Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C上清液分别感染Sf9细胞系(各组左为白光，右为红光））。
[0019] 图5为杆状病毒miRNA表达载体在细胞水平对miRNAs的过量表达。
[0020] 图6为miRNA重组Bacmid在个体水平对miRNAs的过量表达。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]本发明利用杆状病毒载体是一个被广泛应用于真核生物的高效表达外源基因和 重组蛋白的工具，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)表达系统超量表达家蚕let-7簇 miRNAs，为家蚕miRNA的功能研究提供了新的工具。
[0023] 实施例1、重组Red-FastBacl报告基因载体的构建
[0024]从11111?1^86(111^卩：//'\￥?^.111；[1^&86.0找/)下载家香161：-7(131]1〇-161：-7)、家香11111?-100(bm〇-miR-100)、家蚕miR-2795(bm〇-miR-2795)次级前体序列，具体序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，然后从家蚕基因组数据库SilkDB(http:// silkworm, swu· edu· cn/cgi-bin/gbrowse/silkdb/)中获得家香let-7_C(bm〇-let_7_C)全 长序列，具体序列如SEQ ID NO.4所示，从NCBI数据库(http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)下 载珊瑚虫的Red红色荧光蛋白Red基因序列，具体序列如SEQ ID NO.5所示。然后利用 primer5 · 0软件分别设计扩增 bm〇-let-7、bm〇-miR-100、bm〇-miR-2795、bm〇-let-7-C 和 Red 的引物口1'卜161：-7、卩1'；[-11111?-100、卩1'；[-11111?-2795、161：-7-0和1^(1，具体引物如表1所不。
[0025] 表1、pri-let-7、pri-miR-100、p;ri-miR-2795、let-7-C 和 Red 引物序列
[0026]
[0029] 以珊瑚虫cDNA为模板，SEQIDN0.14和SEQIDN0.15为引物进行PCR扩增珊瑚虫 Red基因片段，然后用EcoR I和Spe I双酶切Red基因片段，回收Red酶切片段；同时用相同的 酶酶切pFastBacl质粒，回收pFastBacl质粒骨架，然后分别取回收的lyL pFastBacl质粒骨 架和4yL Red酶切回收片段，用T4连接酶于16°C连接5h，获得重组载体Red-pFastBacl，依次 经转化、挑斑、菌液PCR和双酶切验证后，送深圳华大基因测序鉴定。结果表明克隆的珊瑚虫 Red基因片段与SEQ ID N0.5所示序列一致，表明成功克隆了珊瑚虫Red基因。
[0030] 以刚化蛾家香cDNA 为模板，用引物pri-let-7、pri-miR-100、pri-miR-2795和let-7_C分别扩增miRNA初级前体序列bmo-let-7、bmo-miR-100、bmo-miR-2795和bmo-let-7-C; 50yL反应体系为lOXEx Taq buffer 5yL，dNTP Mixture(2.5mM/L each)4yL，MgCl24yL，弓丨 物各lyL，Ex Taq(5U/yL)0.5yL，cDNA模板4yL，高压灭菌的双蒸水补至50yL;PCR扩增条件： 94°C预变性3min ; 94°C变性30s，Tm