一种活细胞内CdS量子点的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种活细胞内CdS量子点的合成方法，属于纳米荧光材料技术领域。
【背景技术】
[0002]量子点是纳米荧光探针的一种，具有优良的光谱性能，与有机荧光染料相比，更适合于医学焚光成像。在传统的化学合成方法中，有机金属合成法由于有机试剂有毒，合成条件苛刻，并且需要进行复杂的水溶性处理环节才能运用到生物体内，给量子点的进一步应用带来了困难。水相合成法操作简单，重现性好，但是含镉量子点的毒性问题一直倍受争议。近年来，出现了大量使用生物有机体为载体进行纳米材料合成的报道。这些报道中大多以细菌或真菌为载体，通过不同的条件与方法，合成了生物相容性良好的各种类型的量子点。
[0003]肿瘤细胞易于培养，增殖较快。有研究表明，肿瘤细胞中一些物质如谷胱甘肽等含量明显高于正常细胞，而谷胱甘肽是量子点合成中优良的稳定剂及保护剂。细胞内部有着多种活动如生长、分裂等，这些活动可以促进离子间的相互反应，进而调节粒子的成核、生长。通过将一定浓度的离子与细胞共孵育，使其进入细胞内，在细胞的内环境下，以细胞生长代谢活动为动力，促进纳米粒子的合成，不失为一种新型、绿色的合成方法。
[0004]HeLa细胞广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。该细胞有以下几大优点:与其它癌细胞相比，增殖异常迅速，且细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种活细胞内CdS量子点的合成方法，采用以宫颈癌HeLa细胞为载体，以细胞生长代谢活动为动力，以HeLa细胞内源性物质谷胱甘肽为稳定剂和保护剂，通过将镉离子和硫离子先后与HeLa细胞共孵育后，使镉离子和硫离子在细胞代谢活动的驱动下反应成核生成CdS量子点，再通过细胞裂解、破碎、离心等一系列方法处理，制得荧光稳定、性质优良的CdS量子点，其荧光发射波长为450 nm左右，为立方晶型结构，水溶液中量子点的尺寸大小约为3.0 n m;与现有技术相比，该量子点毒性小，生物相容性较传统方法合成出的量子点大大提高，可直接用于生物体系。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的，一种活细胞内CdS量子点的合成方法，以宫颈癌细胞HeLa细胞为载体，利用细胞生命代谢活动为动力制备量子点，具体制备步骤如下:
步骤I)细胞培养:将HeLa细胞置于装有完全培养基的培养瓶中，并放入培养箱(37°C，5%C02)中孵育至细胞密度为80%?90%。
[0007]步骤2)细胞与镉离子共孵育:取出步骤I)装有HeLa细胞的培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含镉离子溶液，其镉离子浓度为0.5-2.5 μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育2?6 h，制得含有镉离子的HeLa细胞; 所述的含镉离子溶液是向完全培养基中加入含镉化合物配制含镉离子溶液，并先后经0.45 μπ^Ρ0.22 μπι滤膜过滤制得。
[0008]步骤3)细胞与硫离子共孵育:取出步骤2)制得的含有镉离子的HeLa细胞培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含硫离子溶液，其硫离子浓度为0.5-2.0 μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育4?32 h，制得含CdS的HeLa细胞;
所述的含硫离子溶液是向完全培养基中加入含硫化合物配制含硫离子溶液，并先后经0.45 μπ^Ρ0.22 μπι滤膜过滤制得。
[0009]步骤4)CdS量子点提取:用细胞刮刀将含CdS的HeLa细胞取出，转移至离心管，10000 rpm离心10 min，用PBS洗涤两次后收集细胞；向所收集的细胞中加入200?500 yLRIPA裂解液(强)，用细胞破碎机将细胞裂解20?40 min，HOOOrpm离心5min，取上清液。
[0010]步骤5)CdS量子点纯化及表征:向步骤4)所得上清液内，加入异丙醇(上清液与异丙醇体积比为1:1-3)使CdS量子点沉淀，3000 rpm离心5 min，取沉淀；重复上述步骤三次后，将沉淀经冷冻干燥即得到量子点粉末;量子点经去离子水稀释，测其光谱及结构性质。[0011 ] 各步骤中所述的完全培养基由90%DMEM高糖培养基和10%血清组成；
所述的DMEM高糖培养基的组成为:D-葡萄糖4.5g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，碳酸氢钠3.7g/L，丙酮酸钠0.110g/L，青霉素80 1]/1111，链霉素0.08 mg/ml。
[0012]所述的步骤I)中，细胞密度进一步优化为80%?85%，且处于对数生长期。
[0013]所述的步骤2)中含镉化合物为氯化镉或硝酸镉。
[0014]所述的步骤3)中含硫化合物为硫化钠。
[0015]所述的步骤2)，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育时间进一步优化为6h。
[0016]所述的步骤3)，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育时间进一步优化为12?30 h。
[0017]所述的步骤5)量子点采用异丙醇进行沉淀，上清液与异丙醇的体积比进一步优化为1:2。
[0018]所述的步骤2)中含镉离子溶液和含硫离子溶液由完全培养基配制，并经0.45μπι和0.22 Mi的滤膜滤过，目的是为了防止细胞染菌，影响实验结果。
[0019]本发明的有益效果在于:
(I)利用宫颈癌细胞HeLa细胞为载体，以细胞代谢活动为驱动力制备CdS纳米量子点。由于对于应用于生物体内的量子点的生物兼容性要求较高，而现有的合成方法中，合成产物对生物体毒性较大，极易对生物体造成伤害。而生物法合成的量子点从细胞中合成，又应用到生物中去，其生物兼容性也大大提高，因此，可以达到某些医疗或诊断方面的要求。
[0020](2)利用肿瘤细胞内源性物质合成量子点。谷胱甘肽是量子点合成过程中常用的稳定剂及保护剂。相关研究表明，肿瘤细胞中谷胱甘肽含量明显高于正常细胞。细胞的生长及分裂过程可以促进离子相互间的反应，进而调节粒子的成核、生长。通过将一定浓度的离子与细胞共孵育，使其进入细胞，在细胞内环境的作用下，以细胞生长代谢活动为动力可以促进纳米粒子的合成。
[0021](3)操作简单。只需要将镉源和硫源先后加入细胞中孵育，无需特殊的实验条件，简单价廉。
[0022](4)应用方便。由于生物相容性较高，毒性较小，所以可以直接用于生物体系。
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例2的CdS量子点的TEM图；
图2是本发明实施例2的CdS量子点XRD表征图。
[0024]【具体实施方式】:
下面通过具体实施案例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
[0025]实施例1:利用氯化镉在HeLa细胞中合成CdS量子点具体合成步骤如下:
步骤I)细胞培养:将HeLa细胞置于装有完全培养基的培养瓶中，并放入培养箱(37°C，5%C02)中孵育至细胞密度为80%，且处于对数生长期；
步骤2)细胞与镉离子共孵育:取出步骤I)装有HeLa细胞的培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含镉离子溶液，其镉离子浓度为1.5μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育6 h，制得含有镉离子的HeLa细胞；
所述的含镉离子溶液是向完全培养基中加入氯化镉配制含镉离子溶液，并先后经0.45μπ^Ρ0.22 μπι滤膜过滤制得；
步骤3)细胞与硫离子共孵育:取出步骤2)制得的含有镉离子的HeLa细胞培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含硫离子溶液，其硫离子浓度为0.5 μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育12 h，制得含CdS量子点的HeLa细胞；
所述的含硫离子溶液是向完全培养基中加入硫化钠配制含硫离子溶液，并先后经0.45μπ^Ρ0.22 μπι滤膜过滤制得；
步骤4)CdS量子点提取:用细胞刮刀将含CdS的HeLa细胞取出，转移至离心管，10000rpm离心10 min，用PBS洗涤两次后收集细胞；向所收集的细胞中加入200 yL RIPA裂解液(强)，用细胞破碎机将细胞裂解20 min，HOOOrpm离心5min，取上清液；
步骤5)CdS量子点纯化及表征:向步骤4)所得上清液内，加入异丙醇(上清液与异丙醇体积比为I: 2)使CdS量子点沉淀，3000 rpm离心5 min，取沉淀;重复上述步骤三次后，将沉淀经冷冻干燥即得到量子点粉末;量子点经去离子水稀释，测其光谱及结构性质；
所述的完全培养基由90%DMEM高糖培养基和10%血清组成；
所述的DMEM高糖培养基的组成为:D-葡萄糖4.5g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，碳酸氢钠3.7g/L，丙酮酸钠0.110g/L，青霉素80 1]/1111，链霉素0.08 mg/ml。
[0026]经检测，制备的CdS量子点发射波长为451nm 实施例2:利用氯化镉在HeLa细胞中合成CdS量子点具体制备步骤如下:
步骤I)细胞培养:将HeLa细胞置于装有完全培养基的培养瓶中，并放入培养箱(37°C，5%C02)中孵育至细胞密度为85%，且处于对数生长期；
步骤2)细胞与镉离子共孵育:取出步骤I)装有HeLa细胞的培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含镉离子溶液，其镉离子浓度为1.0μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°C，5%C02)中孵育6 h，制得含有镉离子的HeLa细胞；
所述的含镉离子溶液是向完全培养基中加入氯化镉配制含镉离子溶液，并先后经0.45μπ^Ρ0.22 μπι滤膜过滤制得；
步骤3)细胞与硫离子共孵育:取出步骤2)制得的含有镉离子的HeLa细胞培养瓶，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗HeLa细胞两次后，加入新配制的含硫离子溶液，其硫离子浓度为1.0 μπιο?/百万个细胞，置于培养箱(37°