一种自由控制丙丁梭菌abe发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高和自由控制ABE发酵丙酮/丁醇比的方法，尤其是利用丙丁梭 菌生产丙酮和丁醇、强化生物丙酮合成的新型发酵方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 丁醇和丙酮都是重要的平台化合物，在化工、塑料、医药、有机合成、涂料和印染等 行业具有广泛用途。同时，生物丁醇是一种极具潜力、清洁可再生的新型液态燃料，可作为 化石燃料的替代品；而丙酮则是优良的柴油助燃剂，它可以提高柴油的燃烧性能、减少有害 气体(N〇x、S〇x等）的排放，环境效益明显（Wu H，Nithyanandan K,Zhang J，et al. Impacts of acetone-butanol-ethanol(ABE)ratio on spray and combustion characteristics ofABE-diesel blends .Appl · Energy，2015，149:367-378)。发展生物燃料和高效燃料添加 剂已成为世界各国应对能源危机、减少温室气体排放、改善气候环境的重要措施。丙酮-丁 醇-丁醇发酵也称为ABE (Acetone-Butanol-Ethanol)发酵，其主产品是丁醇，丙酮是主要副 产品，发酵产物中的丁醇/丙酮/乙醇的摩尔比率大约为6:3:1(质量比约为67:26:7)。目前， 人们更为看中的是丁醇发酵生产，几乎所有研究都集中在高效生产丁醇、抑制丙酮合成，增 加丁醇在总溶剂中所占有的比率(等同于降低丙酮/ 丁醇比），提高原料对丁醇的转化率等 方面。
[0003] 2014年，我国丙酮消费量达130万吨，年增加率逾10%。目前，由于没有专一性发酵 生产丙酮的微生物菌株，丙酮基本上完全(90%以上)依靠不可再生的、化石原料合成生产， 其可持续发展和碳排放存在很大问题。ABE发酵可以生产少量丙酮，但是，多年来，丙酮生物 合成并不受重视。其原因在于：1)发酵浓度太低(一般只有5g/L左右）；2)与主产品（丁醇)抢 夺发酵原料、降低原料的目标转化率。但是，即便丙酮发酵浓度很低，它毕竟也是一个副产 品、而不能简单地抛弃，其产量仍旧要统计到ABE发酵的原料利用报表中去。目前，发酵法生 产丙酮仍利用传统丙丁发酵菌种(丙丁梭菌、拜式梭菌、糖型梭菌等)进行，生产效率低。生 命周期评价(life cycle assessment，LCA)法是一种对多重产品生产过程进行经济评价的 有效方法。它通过对某一过程的产品多样性、产品价格、温室气体排放，以及生产原料的物 性和能量特征进行评估，找出过程经济性、环境效益和产品多样性的最佳切入点，从而实现 生产过程性能的整体最优。有研究报道指出，ABE发酵的LCA和经济性依赖于将丙酮作为重 要平台化合物和高效清洁燃料添加剂的评价（K6hlerKA，Riihl J，Blank L M，et al. Integration ofbiocatalyst and process engineering for sustainable and efficient n-butanol production.Eng.Life Sci. ,2015,15:4-19)。实际上，侧重LCA的 ABE发酵实际上等同于同时强化丙酮和丁醇的合成、并最大可能地提高丙酮/ 丁醇质量比。
[0004] 传统丙丁梭菌实际上也具备高产丙酮的能力。但是，由于ABE发酵存在严重的丁醇 产物抑制，一旦丙丁梭菌间歇式ABE发酵开始，丁醇浓度迅速上升，在较短时间内（40-50h) 达到抑制浓度，丙丁梭菌的产丙酮的能力无法得到体现。一般情况下，最终丁醇浓度和丙酮 浓度分别停留在12-13g/L和5-6g/L左右的水平。使用高效丁醇原位萃取剂-油醇，选择性地 将丁醇萃取到油醇中、控制发酵液相中的丁醇浓度于低水平，发酵液相中的丙酮浓度甚至 可以积累到15g/L左右的高水平(数据未公开）。但是，由于高效丁醇原位萃取剂(油醇)价格 昂贵、原位萃取体系操作难度大，实用上存在很大问题，现在丁醇和丙酮生物合成的主流依 旧是间歇发酵。与丁醇及其合成相比，丙酮及其合成具有截然不同的特征:丙酮合成不需要 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的参与，对细胞的能量供给压力小；丙酮对细胞的毒害作用 小、提高其发酵浓度不会影响溶剂生产效率;丙酮沸点低、蒸馏精制相对容易、精制纯化成 本低。因此，从以下几个方面考虑对ABE发酵过程实施调控，提高生物丙酮的生产效率、提高 或控制丙酮/丁醇比，从强化丙酮合成的角度改善ABE发酵的总体性能是可行的：1)通过环 境胁迫，强化丙丁梭菌(C.acetobutylicum)对于高丁醇浓度环境的耐受能力(Luo H Z，Ge L B, Zhang J S,et al. Enhancing butanol production under the stress environments of c〇-culturing Clostridium acetobuty1icum/Saccharomyces cerevisiae integrated with exogenous butyrate addition,PLoS ONE,2015,10(10): e0141160);2)通过适度降低梭菌胞内的NADH再生速度，改变梭菌胞内碳代谢流的分配、使 较多的碳流走向丙酮合成途径，降低细胞的能量供给压力、使得ABE发酵以高效的NADH再生 模式运车专（Luo Η Z,Ge L B,Zhang J S,etal.Enhancing acetone biosynthesis and acetone-butanol-ethanol fermentation performance by co-culturing Clostridium acetobutylicum/Saccharomyces cerevisiae integrated with exogenous acetate addition.Bioresour .Technol · ,2016,200:43-51); 3)控制发酵体系的还原糖浓度于低水 平、弱化梭菌糖酵解主路的碳代谢速度，进而限制NADH的生成，为高丙酮/ 丁醇比率的形成 创造条件;4)外添乙酸作为共同碳源、维持胞内乙酸浓度于较高水平，提高催化丙酮合成的 辅酶A转移酶（CoAT)的活性（Chen C K，Blaschek H P.Effect of acetate on molecular and physiological aspects of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052solvent production and strain degeneration.Appl.Environ.Microbiol.,1999,65:499-505), 进而强化ABE整体代谢网络中的丙酮合成途径。
[0005] 在申请人前期的研究中，申请人发现，在丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养的操作模式 下、外添少量乙酸可以在维持甚至提高ABE发酵丁醇浓度的同时，较大幅度地提升丙酮的合 成强度和效率。与传统ABE发酵(对照组；丙酮质量浓度约5.0g/L，丙酮/丁醇比0.50)相比， 外添化学合成乙酸时，丙酮质量浓度和丙酮/丁醇（质量）比分别达到8.27g/L和0.59,增幅 分别为41.1 %和18.0%;外添廉价的乙酸发酵上清液时，相应的发酵指标达到8.55g/L和 0.60,增幅分别为46.0%和20.0%，发酵原料成本降低、丙酮发酵生产的可行性提高。发酵 性能改善的原因在于：1)该发酵控制策略可刺激有利于梭菌生存和丁醇合成的4种氨基酸 的胞内分泌，提高了梭菌对高丁醇浓度环境的耐受能力；可以在保证丁醇正常合成的前提 下，适度抑制NADH再生、降低细胞能量周转负担、延缓了梭菌细胞的过早凋亡；可以提高 CoAT的活性、适度强化外添乙酸向丙酮的转化，进而改善了 ABE发酵性能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目标是提供一种可以提高和自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮浓度与丙 酮/ 丁醇比的方法。为实现上述目标，本发明采用的技术方案为:在发酵培养基调制过程中， 将培养基初始还原糖(葡萄糖)浓度控制在20-60g/L的水平，当发酵进入到产溶剂期pH触底 反弹回升0.2-0.3后，控制葡萄糖浓度在接近于0-3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件 直至发酵结束。
[0007] 丙丁梭菌具有分泌淀粉酶(液化)和糖化酶(糖化)的复杂酶系，当葡萄糖浓度降至 接近于〇的低水平后，梭菌可以继续分泌糖化酶、维持葡萄糖于低浓度，限制梭菌胞内糖酵 解途径的碳代谢和NADH的生成速度。
[0008] 为了获得更好的效果可以添入乙酸溶液、强化外添乙酸向丙酮的生物转化，形成 双底物环境。在能量代谢基本不受破坏、丁醇浓度未达到抑制浓度的条件下，适度抑制丁醇 生产、有效地利用乙酸底物，打出时间差、强化丙酮合成。
[0009] 为了获得更好的技术效果，可以在添入乙酸溶液的基础上，再添加一定量的酿酒 酵母，形成丙丁梭菌和酿酒酵母的混合发酵体系，酿酒酵母在严格厌氧环境中仍然可以生 存，利用上述混合发酵体系提高梭菌细胞对高丁醇浓度环境的耐受能力，严格控制葡萄糖 浓度于低水平，最终提高丙酮浓度和丙酮/丁醇比，维持丁醇产量不变。
[0010]乙酸溶液可以使用工业级合成乙酸调配，也可以直接使用乙酸发酵上清液、替代 合成乙酸以降低发酵原料成本。通过使用以上调控手段或策略，可将丙酮浓度和丙酮/ 丁醇 比任意控制在5-12g//L和0.5-1.0的水平，并可维持丁醇浓度于10-148/1的正常水平，充分 满足工业ABE发酵对于丙酮/ 丁醇比的不同需求。由于需要限制还原糖浓度和梭菌胞内糖酵 解途径的碳代谢速度，如果需要获取高丙酮浓度和丙酮/丁醇比，发酵时间将略有延长(55-65h vs 50h)。
[0011] 所述酿酒酵母可选择市售的安琪