一种利巴韦林的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核苷类产品生物技术生产领域，尤其是一种利巴韦林的制备方法。
【背景技术】
[0002] 利巴韦林(Ribavirin)为鸟苷、次黄嘌呤核苷类似物，是一种广谱抗病毒药物，对 多种DNA和RNA病毒均有较好抑制作用。具有作用位点多、不易产生耐药性、疗效高、毒性低， 副作用小等特点，现已用于多种病毒的治疗。在临床上用于治疗丙型肝炎病毒、呼吸道合孢 病毒和拉沙热病毒感染。目前利巴韦林的工业化生产方法主要有微生物发酵法、酶法以及 化学合成法。发酵法存在着生产周期长、容易污染杂菌、利巴韦林提取工艺复杂以及能耗高 等缺点。化学合成法，反应条件苛刻，周期长，需要进行异构体的分离，成本居高不下，而且 容易造成环境污染，所以，在工业化生产中受到一定的限制。酶法克服了发酵法和化学法的 不足，同时生产成本较低，因而是较为有效的工业化生产方法。
[0003] 其中，可以作为酶法合成利巴韦林的起始原料有鸟苷、肌苷、腺苷、胞苷或尿苷等。 由于目前市场上鸟苷的生产成本较低，而且鸟苷作为反应底物时的分解产物为鸟嘌呤，它 的溶解度极低(几乎不溶于水），使得整个反应平衡倾向于利巴韦林的合成方向，因而可以 得到更高的底物转化率。而未反应的底物鸟苷可以被离心后重新利用，反应副产物鸟嘌呤 则可以用作药物阿昔洛韦的原料，所以鸟苷经常作为反应底物，选择PNPase作为催化剂。
[0004] 酶或细胞作为催化剂由于易失活、难以反复使用、不易保藏，限制了工业化应用。 全细胞固定化技术与游离酶和细胞催化相比具有很大优势。细胞固定化避免了的酶的提取 过程，操作相对容易，并且具有更高的操作稳定性。细胞固定化的方法有很多种，适用于细 胞固定化的方法主要有包埋法，吸附法，交联法等，其中包埋法是最为常用的方法。由于细 胞被固定化，减少了转化液中由游离细胞裂解产生的蛋白，降低了提取的困难，减少了提取 成本。
[0005] 在现有技术的基础上，研究一种高纯度利巴韦林的制备方法具有非常重要的生产 实践价值。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种利巴韦林的制备方法，利用酶催化法合 成利巴韦林并对利巴韦林分离提取。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0008] 本发明所用的利巴韦林生产菌，是将以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168 (ATCC 23857))基因组为模板扩增表达的PNPase基因 pupG(核苷酸序列为序列表〈400>1所 示序列），与 pET-His 质粒连接转入 Escherichia coli BL21(DE3)(CICC 23796)中，获得的 大肠杆菌重组菌BL21/pET_Hi s-pupG。
[0009] -种利巴韦林的制备方法，具体方法为：
[0010] (1)以基因工程菌BL21 /pET-Hi s-pupG为菌种，使用发酵罐培养，获得细胞；
[0011] (2)使用明胶包埋细胞，制成固定化重组表达PNPase的全细胞作为催化剂，经酶促 反应得到利巴韦林转化液；
[0012] (3)利巴韦林转化液提取
[0013] a.对利巴韦林转化液8000r/min离心5-10min，获得上清液，将上清液加热至60-80 °C，使用1-2 %的活性炭脱色20-40min，过滤得滤清液；
[0014] b.将滤清液减压蒸发浓缩至1/4-1/3，在0-4°C结晶10-12h，过滤析出的鸟苷，继续 浓缩至利巴韦林即将析出为止，加入纯乙醇，至乙醇终浓度90%左右，利巴韦林浓度35-45g/L，在85-95°C加热，充分搅拌溶解利巴韦林，趁热过滤，将上清在0_4°C结晶l-2d，过滤 制得利巴韦林结晶；
[0015] C.将利巴韦林晶体重新溶解于90%的乙醇，利巴韦林浓度35-45g/L，85-95°C加热 溶解过滤，〇-4°C结晶10_12h，即重结晶，经过两次重结晶后，离心分离、干燥即可得到利巴 韦林纯品。
[0016] 上述利巴韦林的制备方法，最终利巴韦林晶体纯度达到99%以上，提取过程总收 率达到75%以上。
[0017] 优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(1)的具体步骤包括：
[0018] a.斜面活化，37°C培养12-14h，斜面培养基组分（g/L):蔗糖1，蛋白胨10，牛肉膏 10,酵母粉5,NaCl 5,琼脂条25,pH 7.0-7.2;
[0019] b.无菌条件下吸取无菌水于3-5支活化斜面，使用无菌水将菌体重悬后接入5L发 酵罐中，初始装液量为3L，通气量2-4L/min，搅拌转速200-500r/min，通过自动流加氨水控 制pH在7.0，培养温度35-37°C，培养至0D 6Q()= 12-14时，离心收集菌体，发酵培养基(g/L):蛋 白胨 10,酵母粉5，KH2P0U，NaCl 2，MgS〇4*7H20 1，葡萄糖2,乳糖 15，pH 7.0-7.2。
[0020] 优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(2)的具体方法包括：明胶浓度15%， 戊二醛浓度0.5%，细胞包埋浓度100g/L-400g/L，制成固定化重组表达PNPase的全细胞为 催化剂，在20mmol/L的pH 7.0-8.0磷酸盐缓冲液中，底物鸟苷和TCA浓度各100mm〇l/L，进行 酶促反应，固定化重组表达PNPase的全细胞用量10g/L-40g/L，反应温度50-60°C，经酶促反 应16h-28h生产利巴韦林。
[0021]优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(2)中磷酸盐缓冲液pH7.6,酶促反应 温度55°C，细胞包埋浓度200g/L，固定化重组表达PNPase的全细胞用量20g/L，反应周期 20h，连续反应8批次后固定化细胞酶活力基本没有损失，最高转化率可达83 %以上。
[0022]优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(2)所得利巴韦林采用HPLC法进行测 定，使用Agilent 1260型高效液相色谱仪，进样量5yL，流动相:4%乙腈，柱温18.5°C，流速 lmL/min，检测波长207nm。
[0023]优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤（3)b中减压蒸发浓缩条件为：真空 度-0 · 06至-0 · IMpa，温度85-95°C。
[0024]本发明的有益效果是：
[0025] 上述产生利巴韦林的基因工程菌为表达PNPase的大肠杆菌重组菌BL21/pET-His- pupG，通过明胶为固定化细胞包埋材料包埋该细胞进行固定化，利用固定化细胞作为催化 剂，同时对多种影响因素进行优化考察，以鸟苷和TCA为底物，催化制备利巴韦林;具有培养 细胞成本低，固定化过程简便快捷，酶促反应催化效率高，产物利巴韦林分离简单的特点， 因此为固定化细胞法制备利巴韦林的绿色生产工艺提供了一条新的途径，在利巴韦林的工 业化生产领域具有良好的产业化前景。
【附图说明】
[0026] 图1为利巴韦林液相图，其中，（a)利巴韦林标准品，（b)利巴韦林产品。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0028] (1)菌种构建：以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168(ATCC23857))基因组为 模板，设计引物并引入酶切位点及保护碱基，扩增表达PNPase基因 pupG(核苷酸序列为序列 表〈400>1所示序列）。质粒pET-Hi s和扩增片段pupG分别经限制性内切酶BamH I和Nhe I双 酶切，纯化回收后，使用连接酶Solution I在16°C连接12h，连接体系转化DH5a感受态，涂布 于Amp1平板，37°C过夜培养。次日挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，将初步验证为阳 性的单菌落转接摇管，放大培养后提取其质粒，将其进行酶切后做进一步验证。将酶切验证 正确的质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)(CI CC 23796)中，获得大肠杆菌重组菌 BL21/pET-His-pupG。其中，引物序列为序列表〈400>2、〈400>3所示序列： CGCGGATCCAAGGACAGAATTGAACGCGCAG(BamHI)和CTAGCTAGCGTCTTTTGGTCCTGCATTGATTCAT (Nhel)。转化过程:将连接体系全部加入DH5a感受态细胞中，混匀后冰浴30mi η，42°C热激 60s，立即冰浴2min，加入900yL预热过的S0C培养基，于37°C复苏ltuSOOOr/min离心2min，弃 部分上清，留200yL左右将菌体重悬后涂布到Ampr平板，并在37°C继续培养。PCR反应条件： 第一步在95°C预变性5min，在以下条件下进行25轮循环:94°C变性30s，合适的退火温度下 (55°C)退火30s，72°C延伸lmin，最后一个循环完成后，72°C继续延伸10min。
[0029] (2)细胞培养：以BL21/pET-His-pupG为菌种，使用斜面活化，37°C培养14h。无菌条 件下吸取适量无菌水于4支活化斜面，使用无菌水将菌体重悬后接入5L发酵罐中。初始装液 量为3L，通气量2-4L/min，搅拌转速200-500r/min，通过自动流加氨水控制pH在7.0，培养温 度37°C，培养至0D 6Q() = 14时，离心收集菌体。