一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标 记方法，具体为鉴别水稻东野型细胞质雄性不育系、东野型杂交组合以及后代材料的细胞 质来源。
【背景技术】
[0002] 水稻是最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上人口以稻米为主食。随着世界 人口的不断增加和耕地面积的不断减小，如何进一步提高水稻产量，始终是育种家们关注 的首要问题。我国杂交水稻四十余年的实践表明，杂交水稻技术是提高水稻产量的有效途 径。目前，我国杂交水稻的年种植面积约1533.3万hm 2,占水稻种植总面积的50%，产量占稻 谷总产的57%。杂交稻的推广与应用为我国创造了巨大的经济和社会效益。
[0003] 在杂交种制种过程中往往出现机械混杂、生物学混杂，及不法经营者的人为掺杂 或"套牌"，导致杂交种的纯度和真实性受到严重影响，因此为了规范种子市场和保障农业 生产，对种子的纯度和真伪进行鉴定显得十分重要。自1973年，我国杂交水稻三系成功配套 以来，水稻的质核互作型雄性不育在三系(不育系、保持系、恢复系）杂种水稻育种中得到了 广泛应用。迄今，不同的细胞质来源已有六十多种。现今我国杂交稻生产中应用的细胞质雄 性不育类型包括野败型、冈型、D型、印尼水田谷型、矮败型、红莲型、K型、包台型、滇型和马 协型。依据不育系恢保关系的差异，以上细胞质雄性不育系类型主要分为三大类:一、野败 型，与此类不育系恢保关系基本相同的有冈型、D型、印尼水田谷型、矮败型、K型、马协型等； 二、红莲型(HL);三、包台型（BT)，与该类型不育系恢保关系相同的有滇一型、滇三型、里德 型不育系以及由BT型转育成的黎明、农圭六、秋光等粳稻不育系。
[0004]由此可见，水稻三系杂交稻的不育细胞质来源以及品种繁多，其真实性和纯度鉴 定具有一定复杂性。目前种子真实性和纯度鉴定多采用田间种植鉴定，该方法周期长，费工 费时，不能满足种子市场销售和品种及时授权的需要，因此需要操作简单、高效方便的鉴定 方法。其中，DNA分子标记鉴定技术是最佳手段之一，DNA分子标记是一种遗传标记，它能从 DNA水平上反映基因型差异，可以在水稻生长发育的任何阶段进行鉴定，而且能够鉴定表型 难于区别的品种，具有简单快速、准确可靠、对样品要求低及成本低等特点。
[0005] 江西省农业科学院水稻研究所利用东乡野生稻作为细胞质源培育出东野型雄性 不育系，并发现该类型不育系具有与传统"野败"、"红莲"及"包台"不育系完全不同的恢保 遗传关系。为有效区分同核异质体的水稻东野型细胞质雄性不育系和保持系、以及鉴别东 野型杂交种，我们开发了东野型细胞质雄性不育源的线粒体特异DNA分子标记，并提出鉴定 方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供水稻东野型细胞质雄性不育源的特异分子标记以及鉴定方 法，可以准确鉴别东野型细胞质雄性不育源。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] 水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列，跟非东野型细胞质材料的线粒体序 列相比存在多处差异，其中东野型细胞质雄性不育源存在一处特异的多态性位点，相比其 它材料的序列缺失了 l〇bp，缺失的序列为ACCCGGTGGT，其5'和3'侧翼序列分别是 ATAGTAAGGGATTTCTTTCA和ACCCGGAGAAAACGTTGCCC，根据此处序列差异设计了鉴定水稻东野 型细胞质雄性不育源的引物。
[0009] 所述的引物序列如下：
[0010] 正向引物:AGTCGTACCGAACACTATG;
[0011 ]反向引物:TGAACAGATGGGTTTAGTC。
[0012] 本发明另一目的在于提供一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的方法，包括以 下步骤:提取水稻材料的总DNA;以提取的总DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；电泳检测 扩增产物，如果出现92bp的条带，表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源；如果出现 102bp的条带或除92bp以外的其它条带，则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性不育源。
[0013] 所述的PCR反应体系为：模板DNA 1.0yL，10XPCR Buffer 1.0yL，25mM的MgCl21.0 yL，2mM的 dNTP 1 · OyL，0 · 3μΜ的引物 1 · OyL，Taq 酶0 · 2U，加 ddH20 补至 10yL。
[0014] 所述的PCR扩增程序为：1)94°C预变性5min;2)94°C变性20s，55°C退火20s，72°C延 伸20s，扩增32个循环;3) 72°C延伸5min，16°C保温。
[0015] 上述引物或方法对水稻东野型细胞质雄性不育系、东野型杂交组合以及后代材料 的细胞质来源进行DNA分子标记鉴定识别中的应用。
[0016] 本发明的有益效果为：
[0017] 1)本发明所获得的分子标记是根据水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列 跟其它材料线粒体序列的多态性位点设计的，是水稻线粒体基因组特异分子标记，故不需 要作表型鉴定，即可简便、快速、准确地鉴别东野型细胞质雄性不育源，实验重复性好，结果 可靠。
[0018] 2)利用本发明的分子标记对水稻东野型细胞质雄性不育源进行检测，可以鉴定东 野型不育系种子纯度和东野型杂交种真伪。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明实施例八分水稻材料总DNA扩增产物的电泳图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0021 ]实施例1检测水稻细胞质雄性不育系和杂交组合细胞质
[0022] 1)供试材料
[0023]表1八份水稻材料
[0024]
[0025] 2)水稻总DNA提取
[0026] 在苗期取水稻叶片，基因组总DNA的提取参照Scott等（1988)的CTAB法，改进如下： [0027] ①取约O.lg叶片，置于2.0mL离心管中，加入1粒钢珠及500yL 2XCTAB DNA提取液 (20g CTAB，12.1g Tris-Base，7.44g EDTA-Na，81·9gNaCl，溶解于lL蒸馏水中），使用组织 研磨仪打碎叶片，65°C水浴30min，期间振动混匀数次；
[0028] ②从水浴中取出离心管，加入约500yL氯仿(CHC13)，充分震荡混匀，在lOOOOrpm下 离心5min;
[0029] ③转移上清液至一新的1.5mL的离心管中，加入上清体积0.7~1倍的异丙醇，将离 心管轻微混匀后于_20°C冰箱中放置半小时后，lOOOOrpm离心5min;
[0030] ④弃上清液，管底的乳白色沉淀用70%的酒精洗涤两次。将离心管中的酒精倒出 后，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；
[0031] ⑤晾干后的DNA加双蒸水溶解，调节最终浓度为100~lOOOng/yL，置于一 20°C冰箱 内保存备用。
[0032] 3)水稻东野型细胞质雄性不育源特异DNA分子标记的设计 [0033]水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列，跟非东野型细胞质材料的线粒体序 列相比存在多处差异。其中东野型细胞质雄性不育源有一处特异的多态性位点，跟其它材 料序列相比，东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列发生了 l〇bp的缺失。
[0034] 相比其它材料序列，东野型细胞质雄性不育源线粒体基因组缺失的10bp序列为 ACCCGGTGGTb' - 3')，其5'和3'侧翼序列分别是ATAGTAAGGGATTTCTTTCA和 ACCCGGAGAAAACGTTGCCCXS'-S')，根据此处序列差异采用在线软件Primer3(http:// frodo · wi .mit · edu/primer3/)设计了DNA分子标记DW-MT1 〇
[0035] DW-MT1正反引物序列如下：
[0036] 正向引物（5' -3' )AGTCGTACCGAACACTATG;
[0037] 反向引物（5/ _3/ )TGAACAGATGGGITTAGTC。
[0038] 4)基因型分析
[0039]利用标记DW-MT1对表1中的八份水稻材料进行基因型检测，PCR采用10yL反应体 系：模板DNA 1.0yL，10XPCR Buffer 1.0yL，25mM的MgCl21.0yL，2mM的dNTP 1·0μL，0·3μΜ 的引物 1 · 〇yL，Taq酶 0 · 2U，加 ddH20补至 10yL。
[0040] PCR 扩增条件为：1)94°C 预变性 5min;2)94°C 变性 20s，55°C 退火 20s，72°C 延伸 20s， 扩增32个循环;3)72°C延伸5min，16°C保温。
[0041] PCR反应产物在4%琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上拍照。 在检测的八份材料中，东野型不育系DY1A和东野型杂种F1这两份材料扩增出92bp的条带， 其余六份材料扩增出l〇2bp的条带（图1)，电泳谱带清晰、特异，表明使用标记DW-MT1进行 PCR电泳可以准确鉴定出东野型细胞质雄性不育源。
【主权项】
1. 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法，其特征在于：提取水稻材 料的总DNA;以提取的总DNA为模板，用SEQIDN0.1和SEQID如.2所示引物进行？0財广增； 电泳检测扩增产物，如果出现92bp的条带，表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源;如 果出现102bp的条带或除92bp以外的其它条带，则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性 不育源。2. 根据权利要求1所述的一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法，其 特征在于:所述的PCR反应体系为:模板DNA1 ·OyL，10XPCRBuffer1 ·OyL，25mM的MgChl· 0 yL，2mM的dNTPl·OyL，0·3μΜ的引物1·OyL，Taq酶0·2U，加ddH20补至 10yL。3. 根据权利要求1所述的一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法，其 特征在于:所述的PCR扩增程序为：1 )94°C预变性5min; 2)94°C变性20s，55°C退火20s，72°C 延伸20s，扩增32个循环;3) 72°C延伸5min，16°C保温。4. 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的引物，其特征在于:所述的引物核苷酸序 列如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。5. 权利要求1~3中任一项所述的方法、权利要求4所述的引物在水稻东野型细胞质雄 性不育系、东野型杂交组合以及后代材料的细胞质来源鉴定识别中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法，所述的分子标记引物为SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2，所说的方法为：提取水稻材料的总DNA；以提取的总DNA为模板，用上述述引物进行PCR扩增；电泳检测扩增产物，如果出现92bp的条带，表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源；如果出现102bp的条带或除92bp以外的其它条带，则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性不育源。本发明引物可简便、快速、准确地鉴别东野型细胞质雄性不育源，实验重复性好，结果可靠。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483217
【申请号】CN201510896879
【发明人】严松, 黄仁良, 沈显华, 朱珊, 熊宏亮, 沈林军, 魏永清, 陈莉妹
【申请人】江西省农业科学院水稻研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月8日