一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，具体地涉及NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病诊断、治 疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 椎间盘退行性疾病指由椎间盘退变引起的以颈肩腰腿痛为主要表现的一系列临 床综合征，为临床上的常见病和多发病，正在给越来越多的患者带来痛苦，给社会带来经济 负担。目前学学者一致认为，椎间盘退行性疾病受体内外多种因素影响，常见的因素有:遗 传、细胞衰老、基质合成减少、机械负荷、降解酶的增多、炎症因子和细胞凋亡增加等。
[0003] 椎间盘由外部富含胶原蛋白的纤维环和呈凝胶状的结构的髓核构成。椎间盘细 胞，特别是髓核细胞，在维护椎间盘的完整性中起重要作用，它可生成Π 型胶原蛋白，聚集 蛋白聚糖和其他细胞外基质等成分。髓核细胞数量的减少及细胞外基质的丢失是椎间盘退 变的核心特性。最近研究表明，髓核细胞具有维持椎间盘内平衡不可或缺的特性，而其他各 种体外和体内研究同样表明，椎间盘退行性疾病的发展的一个重要原因便是由细胞凋亡引 起的细胞损失。
[0004] 随着基因检测技术的发展，近年来，人们逐渐意识到遗传易感性即遗传因素对于 揭示椎间盘退行性疾病具有重要作用，同时也发现了一些椎间盘退行性疾病相关的基因， 但是目前临床上并没有有效的基因治疗手段。发现新的相关基因并应用于临床，将会对椎 间盘疾病的诊疗起到重要的作用。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于椎间盘退行性疾病 诊疗的分子标志物。与传统的诊断方法相比，使用基因标志物来诊断椎间盘退行性疾病的 具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓风险，针对风险高低，采取 相应的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的 应用，所述基因为NDUFAB1。
[0008] 进一步，上面所提到的诊断产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片检测NDUFAB1基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性疾病的产品。
[0009] 进一步，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增 NDUFAB1基因的引物;所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异 扩增NDUFAB 1基因的引物;所述用免疫检测诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与NDUFAB 1 蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断椎间盘退行性疾病的产品包括:与NDUFAB1基 因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断椎间盘退行性疾病的产品包括:蛋白芯片和基 因芯片;其中，蛋白芯片包括与NDUFAB1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与NDUFAB1基 因的核酸序列杂交的探针。
[0010] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0011] 本发明提供了一种诊断椎间盘退行性疾病的产品，所述的产品能够通过检测椎间 盘髓核组织中NDUFAB1基因的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。
[0012] 进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯 片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针 包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的针对NDUFAB1基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片 包括固相载体以及固定在固相载体的NDUFAB1蛋白的特异性抗体;所述试剂盒包括基因检 测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测NDUFAB1基因转录水 平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括NDUFAB1蛋白的特异性抗体。
[0013] 进一步，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有 硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
[0014] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法 检测NDUFAB 1基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对NDUFAB 1基因的 引物和/或探针。根据SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测NDUFAB1基 因表达水平的引物和探针。
[0015] 与NDUFAB 1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针 的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对 杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不 超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补 序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0016]进一步，所述NDUFAB1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述 NDUFAB1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、 scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与NDUFAB1蛋白的结合能力即可。用于蛋 白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所 述抗体。
[0017]本发明还提供了NDUFAB1基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物 中的应用。
[0018] -方面，本发明所述的"治疗椎间盘退行性疾病的药物"包括能够括促进细胞生 长、抑制细胞凋亡。
[0019]另一方面，本发明所述的"治疗椎间盘退行性疾病的药物"包含NDUFAB1基因和/或 其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制NDUFAB 1基因表达的物质、抑制NDUFAB 1基因表 达产物稳定性的物质、和/或抑制NDUFAB1基因表达产物活性的物质。
[0020] 进一步，本发明所述的治疗椎间盘退行性疾病的药物包括：通过干扰RNA抑制 NDUFAB 1基因表达的双链核糖核酸，或基于NDUFAB 1抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制 NDUFAB1蛋白活性的蛋白质。
[0021] 本发明还提供了一种用于治疗椎间盘退行性疾病的药物，所述药物包含NDUFAB1 基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制NDUFAB1基因表达的物质、抑制NDUFAB1 基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制NDUFAB1基因表达产物活性的物质。
[0022]进一步，本发明所述抑制剂包括:通过干扰RNA抑制NDUFAB1基因表达的双链核糖 核酸，或基于NDUFAB1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制NDUFAB1蛋白活性的蛋白质。
[0023]本发明还提供了上述NDUFAB1基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗椎间盘退 行性疾病药物中的应用。
[0024] 在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守 的、由双链RNA(doub 1 e-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使 用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和 传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面 具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉 默任何目的基因的表达。
[0025] 为了确保NDUFAB1基因能够被高效剔除或沉默，根据NDUFAB1基因的mRNA序列设计 了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et.al 2001， Schwarz et.al 2003,Khvorova et.al 2003,Reynolds et.al 2004,Hsieh et.al 2004, Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgramof Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004,http ://jura.wi.mit.edu/bioc/ siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004 Frost& Sullivan Excellence in Research Award,https://rnaidesigner.invitrogen. com/ sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点