含gus报告基因的转基因材料的pcr检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及含⑶S报告基因的转基因材料的 PCR检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。随着人口增长 和社会的发展，可用于农产品生产的耕地越来越少，依靠传统的育种技术已经很难满足需 求，要想提高水稻产量、质量并解决全球粮食短缺问题，只有通过作物基因工程技术改良和 选育出高产作物品种。植物转基因工程技术，是根据育种目标将人工分离和修饰过的优良 目的基因，通过遗传转化导入受体植物基因组中，使外源基因在受体植物中表达，从而快 速、直接获得可遗传的优良性状的品种。在当今农业生产中，与常规育种相比，转基因技术 具有不可比拟的优势：1、拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源;2、可对植物性状进行定 向定点变异和选择;3、为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径(李文凤，季静(2010)提 高转基因植物标记基因安全性策略的研究进展.中国农业科学09:1761-70)。
[0003] 尽管转基因技术有着诸多的优点，然而在我国，大多数转基因产品仍不能直接商 业化，需要接受严格的监管。因此就需要对产品进行检测。随着转基因技术的发展，外源基 因的检测方法也随之增多，大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类 手段（Querci M，Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6) :1991-2002)。其中蛋白水平的检测实验过程复杂，耗时较长，不利于 转基因成分快速高效的检测。虽然近年开发的转基因试纸条是较为快速的蛋白水平检测方 法，但仅能检测有限数目的蛋白如Bt蛋白，EPSPS蛋白等。基于核酸水平的检测由于其具有 检测方便、体系成熟、可检测范围广及通量高等特点，因此使用较为广泛（Elenis D， Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3): 347-54)。基于核酸水平的检测方法按具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR检测 技术;2、荧光定量PCR检测技术;3、多重PCR检测技术;4、核酸杂交技术检测，包括Southern 杂交和斑点杂交;5、基因芯片检测技术等。其中传统定性PCR检测根据转基因作物转化时惯 用的启动子如花椰菜花叶病毒启动子(CAMV 35S启动子）、胭脂碱合成酶终止子(N0S终止 子）、选择标记新霉素转移酶基因 （NPTII )、外源启动子或终止子与作物基因组的交联结构 基因以及报告基因如β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，⑶S)基因等设计特异性引物，用 体外扩增的方法定性检测转基因样品。该方法操作简便，耗时短，可以建立针对某种作物的 标准化检测体系（Xu CJ,Yang L(2005)Development of a rapid,reliable and simple multiplex PCR assay for early detection of transgenic plant materials.Acta Physiol Plant 27(3) :283-8),是转基因作物中最简便、成熟的外源基因检测方法。
[0004] 提取待检测样品的基因组DNA模板是进行PCR检测的前导步骤，因此，获得较高质 量的基因组DNA是保证PCR检测的准确性和可靠性重要前提。通常需要对基因组DNA进行吸 光值检测其浓度与纯度或者琼脂糖凝胶电泳检测其完整性与降解程度。内参基因标记即是 内部参照，可以作为检测DNA浓度与纯度的参照物，指示实验结果的准确性。如果设计的一 对引物既能检测转基因植株又能作为确定模板基因组来源及质量的内参基因标记，可大大 节约时间和操作成本，提尚转基因样品的检测效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一对用于检测含GUS报告基因的转基因材料的PCR引物，所述 引物不仅能检测到外源报告基因，而且能根据电泳结果中是否含有内参基因，进一步确定 模板基因组DNA是否来源于稻属及其基因组DNA的质量。
[0006] 本发明的另一目的是提供基于上述引物建立的含GUS报告基因的转基因材料的 PCR检测方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供含GUS报告基因的转基因材料的PCR检测引物， 其包括：
[0008] 正向引物：5'-TCAGTGGCAGTGAAGGG-3'（SEQ ID N0:1)
[0009] 反向引物：5'-GAGCGTCGCAGAACATTA-3'（SEQ ID N0:2)
[0010] 该对引物是以⑶S基因序列为依据设计，利用SEQ ID N0:1及SEQ ID N0:2进行PCR 扩增，除了可以获得部分GUS基因序列（扩增产物大小为538bp);还可用于扩增转基因水稻 样品中的内参基因（扩增产物大小为1491bp)，作为检测样品是否为水稻的依据，同时可指 示基因组DNA的质量。且该对引物没有品种特异性，在籼稻、粳稻(例如水稻品种中花11、日 本晴、冬瑾、93-11、MH63等）中均适用。所述含⑶S报告基因的转基因材料是携带⑶S报告基 因 （SEQ ID N0:3)的载体，如植物双元表达载体DX2182;通过遗传转化获得的含此GUS报告 基因的愈伤组织、幼苗、种子等。
[0011]本发明还提供含有上述引物的用于检测含⑶S报告基因的转基因材料的试剂盒。 [0012]所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等 中的至少一种。
[0013] 本发明还提供所述试剂盒在检测含GUS报告基因的转基因材料中的应用。所述转 基因材料包括转基因水稻、玉米、小麦、大豆、棉花等转基因作物。
[0014] 本发明还提供含⑶S报告基因的转基因材料的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0015] 1)提取待测样品中的DNA;
[0016] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应；
[0017] 3)分析PCR产物。
[0018] PCR反应体系以 20μ1计为：10 X PCR反应缓冲液(Mg2+Plus) 2μ1; dNTPs (各2.5mM) 1μ 1;10μΜ正向引物 1μ1;10μΜ反向引物0·5μ1;模板DNA 2μ1;?υ/μ1 Taq DNA聚合酶0·5μ1; ddH20 补足至 20μ1。
[0019] PCR反应程序为:95°C5分钟；94°C30-45秒，55°C30-45秒，72°C 1.5分钟，共30-35个 循环;72°C10分钟。
[0020] 利用上述方法可以快速检测和鉴定转基因样品是否携带GUS报告基因及遗传背景 是否为稻属。
[0021] 步骤3)中对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果只扩增出一条538bp(SEQ ID N0: 3)大小的条带，则表明该样品为含GUS报告基因的转基因材料，但遗传背景并非水稻;如果 同时扩增出538bp和149 lbp大小的两条条带，则表明待测样品为含GUS报告基因的转基因水 稻;如果只扩增出一条1491bp(SEQ ID N0:4)大小的条带，则表明该样品为非转基因水稻。 [0022]本发明进一步提供一种水稻基因组检测内参基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4 所示。
[0023] 用于扩增上述内参基因的特异性PCR引物，其包括：
[0024] 正向引物：5 ' -TCAGTGGCAGTGAAGGG-3 ' 和
[0025] 反向引物：5 ' -GAGCGTCGCAGAACATTA-3 '。
[0026] 本发明利用普通PCR方法即可检测转基因材料中外源GUS报告基因是否插入植物 基因组，同时利用本发明提供的引物可以扩增水稻基因组特有序列，直接对水稻基因组进 行标记，即PCR产物电泳时以此序列作为内参基因，可以直观的分辨出基因组模板DNA是否 为水稻以及判断模板DNA的质量，消除了普通PCR扩增时模板DNA质量的不确定性。因此，本 发明提供的PCR检测引物及检测方法，既可用于检测含GUS报告基因的转基因样品，又可用 于确定模板基因组DNA是否来源于稻属及其基因组DNA的质量。该方法简单、快捷，成本低， 实验结果直观清晰。
【附图说明】
[0027]图1为本发明实施例2中含GUS报告基因的转基因植株的PCR检测结果;其中，左侧 第一泳道-:H20(阴性对照）；左侧第二泳道-:ZH11;左侧第三泳道+: DX2182载体；1-12 : DX2182的不同转基因株系;Ref:内参基因扩增片段;GUS:GUS基因扩增片段。
[0028] 图2为本发明实施例3中不同水稻品种中内参基因的PCR检测结果；其中，Μ : 2000marker; 1: Η20; 2 : ΖΗ11; 3 :日本晴；4: Dong jin; 5 :93-11; 6 :ΜΗ63 ; 7 : Η20; 8 : ΖΗ11; 9 : DX2182〇
[0029] 图3为本发明实施例4中引物灵敏度检测结果;其中，M:2000marker;l-8:转基因水 稻材料DNA浓度稀释倍数依次为ΙΟΜΟΛ
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册