乳腺癌的诊断标记物的制作方法

文档序号:9722790阅读:587来源:国知局
乳腺癌的诊断标记物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域,具体地涉及一种乳腺癌的诊断标记物一 C2orf88基因。
【背景技术】
[0002] 目前,乳腺癌已成为全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,也是引起女性死亡 的重要病因。近年来,乳腺癌在我国的发病率呈总体上升趋势,根据目前乳腺癌的发病趋 势,预计到2030年,乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万。
[0003] 临床上用于乳腺癌诊断的方法包括:影像学检查如乳腺X线摄影(乳腺钼靶照相)、 彩超、乳腺磁共振检查(MRI)等;细胞病理学检查和组织病理学诊断;乳头溢液检查如乳管 镜、乳腺导管造影、溢液细胞学涂片等。
[0004]临床上根据乳腺癌的不同分期酌情进行个体化综合治疗,是提高疗效的关键;治 疗方法包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段。外 科手术仅适用于乳腺癌分期较早的患者,而放、化疗副作用较大,特异性差,对瘤体组织及 正常组织均会造成损伤,对病人的伤害较大,总体临床疗效欠佳。因此人们致力于寻找副作 用更小、更为有效的治疗方法。
[0005] 随着生物学技术的发展及诊疗手段的不断提高,乳腺癌的研究已取得了长足的进 展。目前,传统的病理形态学诊断及分期已不适应肿瘤学研究的发展需求,应用分子诊断技 术,对肿瘤发生、发展的病理学机制及生物学行为从分子水平上加以研究已成为当前的研 究方向。乳腺癌是一类分子水平上具有高度异质性的疾病,即使组织形态学相同的肿瘤,其 分子遗传学改变也可能不尽一致,从而导致肿瘤治疗和预后的差别。尽管现在已经报道了 一些基因与乳腺癌发生、发展相关,但是目前临床上并没有有效特异性乳腺癌分型分子诊 断标记物。寻找新的基因标记物,在分子水平上对乳腺癌进行诊疗具有重要的意义。

【发明内容】

[0006] 为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种可用于乳腺癌早期诊断的 分子标志物C2orf88基因,与传统的诊断相比,采用该标记物进行诊断,能特异性的诊断 luminal B型乳腺癌,从而为乳腺癌的治疗及预后提供较为有效的手段。
[0007] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0008] 本发明提供了一种C2orf88基因及其表达产物在制备诊断乳腺癌的产品中的应 用。
[0009] 进一步,所述乳腺癌为luminal B型乳腺癌。
[0010]进一步,所述产品通过检测C2orf88基因及其表达产物的表达水平来诊断乳腺癌。 [0011] 进一步,所述检测C2orf88的表达水平的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免 疫检测、原位杂交或芯片进行检测检测C2orf88基因及其表达产物的表达水平以诊断乳腺 癌的产品。
[0012] 进一步,所述用RT-PCR诊断乳腺癌的产品至少包括一对特异扩增C2orf88基因的 引物;所述用实时定量PCR诊断乳腺癌的产品至少包括一对特异扩增C2orf88基因的引物; 所述用免疫检测诊断乳腺癌的产品包括:与C2orf88蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂 交诊断乳腺癌的产品包括:与C2orf88基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断乳腺癌 的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括与C2orf88蛋白特异性结合的抗体, 基因芯片包括与C2orf88基因的核酸序列杂交的探针。
[0013]本发明提供了一种诊断乳腺癌的产品,所述的产品能够通过检测乳腺癌组织中 C2orf 88基因的表达水平来诊断乳腺癌。
[0014] 进一步,所述乳腺癌为luminal B型乳腺癌。〇
[0015] 进一步,所述产品包括芯片、或试剂盒。其中,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯 片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探 针包括用于检测C2orf88基因转录水平的针对C2orf88基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯 片包括固相载体以及固定在固相载体上的C2orf88蛋白的特异性抗体;所述试剂盒包括基 因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测C2orf88基因转 录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括C2orf88蛋白的特异性抗体。其中,所述试剂 包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测C2orf88基因表达水平 过程中所需的试剂。优选地,所述试剂包括针对C2orf88基因的引物和/或探针。
[0016] 所述基因芯片还可用于检测包括C2orf88基因在内的多个基因(例如,与乳腺癌相 关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括C2orf88蛋白在内的多个蛋白 质(例如与乳腺癌相关的多个蛋白质)的表达水平。所述基因检测试剂盒还可用于检测包括 C2orf88基因在内的多个基因(例如,与乳腺癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫 检测试剂盒可用于检测包括C2orf88蛋白在内的多个蛋白质(例如与乳腺癌相关的多个蛋 白质)的表达水平。通过将多个与乳腺癌的标志物同时检测,可大大提高乳腺癌诊断的准确 率。
[0017] 进一步,所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有 硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
[0018] 进一步,所述基因检测试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增 C2orf88基因和管家基因的引物对;所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含:PCR缓冲液、 dNTPs、SYBR Green荧光染料。
[0019] 进一步,所述扩增C2orf88基因的引物对序列如下:正向引物序列为5'-CTGTGATCTTGGAATATG-3' ;反向引物序列为5'-CTCTCAATGTATGGAATG-3' ;所述管家基因为 GAPDH,扩增GATOH的引物序列对如下:正向引物序列为5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3' ;反 向引物序列为5 ' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3 '。
[0020] 本发明的C2orf88基因可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达C2orf88 的DNA片段的载体转染宿主细胞获得。所述载体所述载体包括真核表达载体、病毒载体。
[0021] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCDNA3.0表达载体、 pcDNA3.1表达载体、pCMV-My c表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTe t表达载体、 pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pCAMBIA1301、pBin438 等。
[0022] 病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱 疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及埃博拉病毒)载体、甲病毒载体、腺病毒相关病毒载 体。
[0023]本发明中C2orf 88蛋白或编码C2orf 88蛋白的核酸可以通过脂质体给予。
[0024] 本发明中与C2orf 88基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、 PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特 异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所 述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长 一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
[0025]本发明中所述C2orf88蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述 C2orf88蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰,例如,嵌合抗体、 scFv、Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与C2orf88蛋白的结合能力即可。用于检 测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的,并且本发明可以使用任何方法来制 备所述抗体,如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
[0026] 在本发明的上下文中,"C2orf88基因"包括人C2orf88基因以及人C2orf88基因的 任何功能等同物的多核苷酸。C2orf88基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank 中C2orf88基因(NC_000002.12)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的 DNA序列;
[0027] 优选地,C2orf88基因的编码序列包括以下任一种DNA分子:
[0028] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列;
[0029] (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
[0030] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地,90%以上同源性,且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0031]在本发明的具体实施方案中,所述C2orf88基因的编码序列是SEQ ID N0.1所示的 DNA序列。
[0032] 在本发明的上下文中,C2orf88基因表达产物包括人C2orf88蛋白以及人C2orf88 蛋白的部分肽。所述C2orf88蛋白的部分肽含有与乳腺癌相关的功能域。
[0033] "C2orf 88蛋白"包括C2orf 88蛋白以及C2orf 88蛋白的任何功能等同物。所述功能 等同物包括C2orf88蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、 天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人C2orf88的DNA杂交的DNA所编码的 蛋白质。
[0034]优选地,C2orf88蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白质:
[0035] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0036] (2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个,较佳地1-30 个,更佳地1-20个,最佳地1-10个。
[0037] (3)与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性), 优选地,与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性,常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0038]在本发明的具体实施方案中,所述C2orf88蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸 序列的蛋白质。
[0039] 通常,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技 术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插 入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基 酸的保守替换表是本领域公知的。
[0040] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是C2orf88蛋白的融 合蛋白。对于与C2orf88蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留 C2orf88蛋白的生物学活性即可。本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物,这些衍生物可以 是但不局限于不同形式的盐、修饰产物等,如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修 饰,所用修饰剂包括但不限于聚乙二醇、葡聚糖等。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋 白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。
[0041 ]本发明的C2orf88蛋白也包括对SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修饰,只 要经过修饰的蛋白质仍然能够保留C2orf8
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