一种基于高通量测序的10个str位点的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序的10个STR位点的检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 重复系列是真核基因组序列的重要组成部分，目前作为遗传标记的序列都属于基 因组的重复区，在众多的重复序列中，短串联重复(STR)是目前被广泛应用的遗传标记，尤 其是在法医学领域。STR是由2_6bp的核酸序列组成的串联重复单元组成，其长度一般在几 十到几百的碱基之间。STR在整个人类基因组中分布非常广泛，平均10000个碱基就会出现 一个STLSTR序列短，易于扩增，对于两个等位基因之间没有差异扩增存在，因此适用于微 量和降解检材，由于其在不同个体中的高度多态性，能够有效识别不同的人类个体。
[0003] 传统STR检验基于毛细管电泳技术根据电泳后片段大小的多态性进行分型，存在 很大的局限性。一是所含信息量有限，对于混合样本检验，复杂亲缘关系检验等无法准确区 分。二是无法解决STR内部的变异情况，比如有些重复单元发生了突变，仅通过电泳无法区 分。三是传统的STR检验技术只能通过DNA分子的荧光强度判断分型，只能做到定性分析，无 法准确的定量。
[0004] 基于二代测序进行STR分析相比传毛细管STR检测平台具有显著优势:第一，毛细 管电泳仅区分等位基因的片段大小，核苷酸数量相等的所有等位基因被认为是同一个等位 基因；二代测序技术可明辨DNA序列，展示出STR等位基因重复单元和侧翼序列的真实差异。 第二，二代测序对降解检材进行STR分析具有优势。毛细管电泳采用多色荧光复合扩增技 术，为在各色荧光中安置更多的基因座，设计引物时经常有意保留较长的侧翼序列，导致扩 增效率降低，不利于降解检材分型。利用二代测序技术进行STR分型，各基因座片段长度完 全可以重叠在小片段区域且互不干扰，相当于将更多的常规STR基因座作为Mini-STR基因 座使用，对降解检材分型效果自然更好。第三，基于二代测序的STR分型在现有数据输出方 式基础上，允许进一步关注STR的序列多态性，对STR基因座进行精细化分型，显著提升STR 基因座的个体识别能力。由于目前新一代测序技术(NGS)已经广泛应用于基因组测序的各 个领域，基于新一代测序技术的优势，开发基于NGS的STR法医试剂盒将比传统的试剂盒更 有优势。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒，该试剂 盒可同时扩增的 10 个基因座为：D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、 DYS393、DYS460、DYS570和Amel。
[0006] 在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包含扩增基因座的引物，具体如下：
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[0008] 在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含FastStart DNA Polymerase PCR bufTer(Roche)，dNTP(Roche)，FastSta;rt DNA Polymerase(Roche)和BSA。
[0009] 本发明所述检测试剂盒可以检测多种人体DNA样本，例如源于人血液、唾液、毛发 或精斑等DNA样本。
[0010] 根据对中国人群具有高度遗传多态性和良好的等位基因频率分布分析，本发明检 测试剂盒选择 D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、DYS393、DYS460、 DYS570和Amel共10个STR基因座进行扩增，其中Amel为性别鉴定基因座。通过分析，特别是 D6S477、D18S535和DYS460基因座在中国人群中遗传多态性远高于其他STR试剂盒所选择的 基因座，提高了整个试剂盒的个体识别能力，非常适合在中国人群的个体识别鉴定中应用。
[0011] 在检测DNA样本时，本发明试剂盒的具体扩增体系如下：
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[0014] 本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的检测方法，所述检测方法仅用于个体鉴 另|J;具体步骤如下：
[0015] 1)取人源DNA样本，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下:95°C变 性5min; 94°C变性30s; 60°C退火lmin; 70°C延伸lmin; 60°C最后延伸60min;共28个循环；
[0016] 2)用磁珠纯化上述PCR产物，洗脱；
[0017] 3)建DNA文库并定量；
[0018] 4)Miseq测序，软件分析结果。
[0019] 本发明提供一种利用新一代MiSeq测序技术对人类的10个STR位点进行高通量测 序的试剂盒，包括扩增体系，测序的读长的统计，以及测序结果分析最终提供每个STR点的 分型结果。本发明利用了新一代的MiSeq测序技术对STR进行测序，相比于传统的毛细管电 泳，此技术能够提供更深的覆盖，能够分辨出STR内部的碱基突变情况，另外的一个优点是 可以将不同的引物进行混合扩增，一次性得到所有STR的扩增产物，然后进行测序。另一个 优势是此发明不依赖于测序仪进行最终的STR分型，只需要将测序的原始读长和每个STR的 标准ladder分型通过生物信息学手段进行比较，即可确定最终的分型结果。
【附图说明】
[0020] 图1:实施例1检测DNA样本结果。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下 说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。 本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
[0022] 实施例1
[0023] 本发明试齐1丨倉组成：
[0026]引物混合物组成如下：[0027]
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[0028] 检测方法：
[0029] 1)取人源DNA样本lng/μL，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下： 95°C 变性 5min; 94°C 变性 30s; 60°C 退火 lmin; 70°C 延伸 lmin; 60°C 最后延伸 60min;共 28 个循 环；
[0030] 2)用0.9 X SPRI磁珠纯化上述PCR产物，20μ1洗脱。Qubit定量浓度。
[00311 3)用ΚΑΡΑ Hyper Prep Kit试剂盒建库，建库起始模板定量5ng。
[0032] 4)用ΚΑΡΑ Library Quantification Kit文库定量。
[0033] 5)用MiSeq测序，150SE 10M reads。
[0034] 6)Miseq测序数据统计，采用Miseq 2x150bp的pair-end双末端测序，测序后的原 始读长序列分为正向读长和反向的读长，通过FLASH软件将正反向的读长序列进行合并，合 并的参数是100%的相似性，两端至少重叠 l〇bp，命令为
[0035] ./flash-max-mismatch-density=0str