锰基磁共振造影剂的制作方法
【专利说明】猛基磁共振造影剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月7日提交的美国专利申请第61 /749，614号的优先权。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明经政府支持在国家癌症研究所(National Cancer Institute)和国家研究 资源中心（National Center for Research Resources)授予的基金号CA161221 和RR14075 的资助下完成。政府对本发明拥有某些权利。
[0005] 发明背景 1 .发明领域
[0006] 本发明涉及用于磁共振成像的造影剂。本发明还涉及用于制备所述造影剂的方 法。 2.【背景技术】
[0007] 当基质（例如人类组织)受到均匀磁场(极化场Bo)作用时，该组织中的激发核的各 磁矩会趋于沿着该极化场排列，但是以它们的特征拉莫尔频率(Larmor frequency)以随机 次序围绕该极化场进动。如果该基质，或组织，受到位于χ-y平面内并且具有接近拉莫尔频 率的磁场（激励场以）作用时，则沿着磁场方向的净磁矩（Mz)，可能会旋转或"翻转 (tipped)〃进入该x-y平面，以产生横向的净磁矩Mt。由所述激发核或〃自旋（spin) 〃发出信 号，在该激发信号出结束之后，该信号可被接收并处理以形成图像。
[0008]在磁共振成像(MRI)系统中，激发的自旋诱导接收线圈中的振荡正弦波信号。该信 号的频率接近拉莫尔频率，并且其初始振幅通过横向磁矩Mt的大小来确定。发出的NMR信号 的振幅(A)随时间（t)以指数形式衰变。衰变常数1/T* 2取决于磁场的均匀性和!^，其被称为" 自旋-自旋弛豫"常数，或"横向弛豫"常数。该Τ2常数与，从完全均匀磁场去除激发信号出之 后，所述自旋沿磁场进动将会发生的去相位的指数速率成反比。Τ 2常数的实际价值是:不同 组织会具有不同的^值，而这可被用作提高所述不同组织之间的对比度的手段。
[0009]对NMR信号的振幅Α产生作用的另一个重要因素被称作：自旋-晶格弛豫过程，其用 时间常数!^来表征。其描述:净磁矩Μ沿着磁性极化的轴(z)朝向其平衡值的恢复弛豫与 自旋相干性的减小相关联，而h弛豫的出现归因于探测位点的顺磁性迀移，以及结合的质 子与周围的体相水(bulk water)的后续交换。^时间常数(其被称作"自旋-晶格弛豫"常数 或"纵向弛豫"常数)比T2*，在医学领域感兴趣的大多数基质中要长得多。如同T 2常数，可利 用不同组织之间的h的差异来提供图像对比度。
[0010] 这些弛豫时间常数的倒数被称作弛豫速率，并且表示为办和此，其中R! = 1/h，而R2 =I/T2 ο
[0011] 造影剂是能够改变组织的弛豫性质，并且诱导图像对比度的外源性分子或物质。 造影剂通常是顺磁性、超顺磁性或铁磁性物质。造影剂有时也被称为成像探针。
[0012] 所给造影剂能够改变弛豫速率的程度被称为弛豫度(relaxivity)。弛豫度定义为 采用造影剂和不采用造影剂检测的样品的弛豫速率差异。然后，使该弛豫速率差异对于造 影剂的浓度进行标准化。弛豫度表示为小写字母"r"，所带下标"Γ或"2"分别指的是纵向或 横向弛豫度。例如，纵向弛豫度(η)定义为其中心是存在造影剂时检测到 的弛豫速率（以?Γ 1计hR，是不存在造影剂时检测到的弛豫速率（以?Γ1计），而C是造影剂的 浓度（以mM计）。弛豫度的单位是:πιΜΛ'对于包含多于一种金属离子的造影剂，弛豫度可 以金属离子浓度的方式（7离子或'离子弛豫度'）表达，或者以分子浓度的方式（7分子'或 '分子弛豫度'）表达。弛豫度是造影剂的固有性质。
[0013] 为了引发临床上希望的对比度，已经开发出了经设计以影响弛豫时长的MRI造影 剂。意料之中的是，存在临床上用于调节^对比度的造影剂，和临床上用于调节^对比度的 造影剂。
[0014] Tr加权的（T1W)成像提供这样的图像对比度：当水在某一组织或区域中具有短h 时，图像中的该组织或区域是明亮的（信号强度增加）。增加图像对比度的一种方式是给予 基于钆(Gd)、锰(Μη)或铁的顺磁性络合物或物质。这种顺磁性造影剂使水分子所对应的h 变短，从而导致正性图像对比。如上所述，所给造影剂的浓度能够改变!^的程度代表弛豫 度。弛豫度较高的化合物提供的Tw信号增强大于弛豫度低的化合物;或者，高弛豫度化合 物可以提供与低弛豫度化合物等同的信号强度，而在该情况下，其所需浓度低于低弛豫度 化合物。因此，高弛豫度化合物是人们希望的，因为它们能够提供病灶出的较大增强，从而 提高诊断置信度;或者，它们可以较低剂量使用，从而改善造影剂的安全系数。
[0015] 临床应用中主要采用的磁共振造影剂是+3氧化态的钆离子。+2氧化态的锰离子也 可被用作1'1弛豫剂。猛福地吡(13]^3；1；'〇(1丨口；[1')(冠以商标名称16 81380311，以猛福地吡三钠 (mangafodipir trisodium)销售)是一种造影剂，其经静脉内递送以增强肝的磁共振成像 (MRI)中的对比度。它包含顺磁性锰(II)离子和螯合剂福地吡(二磷酸二吡哆盐）。锰缩短纵 向弛豫时间（??，从而使正常组织在磁共振图像中显得更加明亮。弛豫度与Gd基造影剂一 样高的Μη基试剂已被描述(参见例如，Inorg Chem 43:6313-23,2004)。
[0016] 钆磁共振造影剂的一个缺点是，生理学条件下，钆离子仅在+3氧化态状态下稳定。 此外，钆基造影剂在肾功能受损患者中的应用与被称为肾源性系统性纤维化(NSF)的罕见 但严重的纤维化疾病之间存在成熟建立的联系。
[0017] 锰基磁共振造影剂的进一步改进在增强对比度的应用中将有巨大可用性。在生理 学条件下，锰能评估多种氧化态，其中+2氧化态最适于TjPT 2对比度。这可被用于非侵入性 的组织氧化还原动力学研究。对于NSF风险较高的患者群体，锰基造影剂还可作为钆的可行 替代物。
[0018] 发明概述
[0019] 在健康组织中，胞内和胞外氧化还原环境是经严格调控的，并且与细胞的生理学 状态紧密相关。然而，在细胞应激、损伤或细胞死亡期间，该调控常被扰乱。虽然局部氧化还 原状态的动力学在介导各种生物过程(例如细胞周期进程、免疫应答和创伤愈合）中起重要 作用，但已将胞外氧化还原环境的持续失调与多种病理学(包括慢性炎症、肿瘤生长和癌细 胞侵袭)联系起来。事实上，氧化还原在肿瘤生物学中所起的作用始终是一大活跃研究领 域，并且是当前开发中的多种氧化还原活化的前药的聚焦点。新成像方法必然会促进这些 努力，同时进一步增进我们对于氧化还原动力学与疾病的关系的基础理解。
[0020] 已经报道了若干氧化还原活化的分子成像探针，其各自利用独特的活化机制以针 对氧化还原环境的特定方面。这些探针中的一些靶向缺氧(低氧压）的组织，该缺氧状况可 因肿瘤中有时出现的对受影响区域的血液供应中断或血管形成不充分所致。正电子发射断 层扫描探针 18F-氟咪索硝唑(18F-MIS0)和64Cu-二乙酰-双(N4-甲基氨硫脲）（ 64CU-ATSM)已在 临床上应用以对肿瘤缺氧区域成像。已证实电子顺磁共振(EPR)成像和基于氧化还原敏感 性的氮氧自由基的光谱探针有效于检测巯基化合物以及其它还原性物质的相对丰度。磁共 振(MR)探针也已有报道。示例包括Gd(III)络合物，其中配体能够形成可逆二硫键，由此胞 外蛋白质的半胱氨酸侧链提供局部氧化还原状况的间接视图，Mn(III)-卟啉，其经历还原 作用成为在缺氧条件下具有较高弛豫度的Mn(II)物质，以及最近报道的，Eu(III)络合物 对，其可在β-NADH存在时通过配体侧臂的还原而被活化。
[0021] MR是一种图像氧化还原动力学的具有吸引力的疗法，因为其允许对完整、不透明 的有机体进行三维检测，其在高场系统上具有细胞分辨率(约?〇μπι)，且在临床扫描仪上具 有亚毫米分辨率。MRI的深组织穿透力和高分辨率使其能够直接翻译从细胞到小鼠到人类 的结果。
[0022] 采用氧化还原敏感性MR探针的一个方式是采用氧化还原活性金属离子。用于大多 数MR探针中的Gd(III)在水性介质中仅具有一种稳定的氧化态。然而，锰能够根据配位场以 多种氧化态稳定存在。高自旋Mn(II)络合物还能产生与最佳Gd(III)络合物相当的弛豫度， 并且，近期已有尝试采用Mn(II)络合物作为MR探针。本文中，我们提出基于Mn(II)/Mn(III) 氧化还原对的一类新型氧化还原活化的MR探针。
[0023] 锰离子能够稳定地或亚稳定地以不同的氧化态存在。我们已确认了锰以不同氧化 态存在的能力的优势。我们显示，能够制出结合至锰的配体，并使其稳定在+2和+3氧化态。 Mn(II)络合物的弛豫度远高于Mn(III)类似物。我们还显示，能够以导致一种氧化态被优选 的方式来修饰该Μη结合配体。该氧化还原活性络合物的好处在于，它们能够起到传感器的 作用。例如，我们显示，Μη(ΙΙΙ)络合物可通过谷胱甘肽的生理学浓度被还原成Μη(ΙΙ)络合 物，这进而导致磁共振信号增加。因此，这些络合物能够作为谷胱甘肽或其他生物学还原剂 的传感器。
[0024] 我们还显示，某些锰络合物能够随pH变化而改变其弛豫度。酚盐-0和磺酰胺-Ν配 体均为酸可分离的，并且调节锰和体相水的相互作用，这影响弛豫度。在我们的实施例中， 弛豫度随pH降低而增加，从而这些化合物能够作为pH和酸中毒的传感器。酚盐和磺酰胺供 体的pK a值是高度模块化的，并且经得起合成性微调的检验。低胞外pH是组织局部缺血（例 如，中风、缺血性心脏病、肾缺血)和许多肿瘤的标志。
[0025]我们还开发了一种新型配体，称为CyP3A。该配体被设计为以热力学稳定和动力学 惰性的方式与Mn(II)螯合，同时允许Mn(II)与水发生直接相互作用。动力学数据指示， CyP3A的锰络合物对Zn (II)金属转移的惰性高于⑶TA (环己二胺四乙酸）的Μη (II)络合物， 其显示出优于文献的前述特征的最佳平衡。CyP3A的吡啶基-Ν供体是模块化的，并且提供附 加另一个配体供体的简易方式，其能够可逆地占据由水占据的配位点。该支架对于可能的 pH-传感应用而言是理想的。
[0026]此外，我们制备了包含六个Mn(II)螯合剂的高分子量O2000MW)的多聚体。高分子 量使分子在溶液中的翻转更为缓慢，并且显著提高了 Mn(II)弛豫度。
[0027] Μη基造影剂的另一个好处在于，存在发出正电子的锰同位素(Mn-51和Mn-52)，这 使将这些络合物作为正电子发射断层摄影(PET)剂的应用成为可能。此外，通过用PET同位 素交换天然Mn-55,能够简易地制备双重MR-PET探针。此类探针能够用于新型复合型MR-PET 扫描仪，其中这两种方式均可用于检测该探针。该方法的一个好处在于，能够对生理学参数 (例如pH、还原电位或离子流量)进行更加准确、定量的检测。
[0028]通过以下详述、附图和所附权利要求书可以更好地理解本发明的这些特征、方面 和优点，以及其他的特征、方面和优点。
[0029]附图简要说明
[0030] 图1显示配体结构强力影响Μηπι/Μηπ对的氧化还原电位。羧酸供体向酚供体的转 化使半电池电位迀移了有利于较高氧化态的649mV。
[0031] 图 2 显示：图（a)中，内含 Mnn-HBET(25mM)的 25mM TRIS 缓冲液（pH = 7.4)以 500mM KN〇3作为支持电解质的100mV/s下的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K 3Fe(CN)6;而图（b) 中，是Mn2+/Mn3+对-i a(递减线）和(递增线）对比，v(其中v =扫描速率）的科特雷尔 (Cottrell)图。
[0032] 图3显示：左图：以4.7T的内含纯水、pH 7.4TRIS缓冲液中的0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ和 0.5mM Μηη-ΗΒΕΤ的管记录的IV加权的MR图像。右图：以室温和4.7Τ检测的弛豫度。
[0033]图4显示(a)经375nm处处的特征紫外吸光度测定，在TRIS缓冲液(pH7.4,37°C)中， 通过10mM GSH从0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ还原成Μηπ-ΗΒΕΤ导致增加的质子弛豫速率（1/T!，左轴） 和随之减少的Mn m-HBET的摩尔分数(右轴）。（b)由LC-MS在26°C监测，通过ImM GSH的0 · 5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的还原。在还原过程中没有观察到长久存在的中间体物质。
[0034] 图5显示氧化环境和还原环境中的Μη2+/Μη3+造影剂。
[0035]图6显示2'-((2-((羧甲基）（2_羟基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸（IfflET) (3) 、2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(HBET-0Me) (8)和2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸(HBET-N02) (12)的完整合成方案。
[0036]图7显示(a)配体HBET⑶的分析LC-MS痕迹，其中在220nm处的痕迹（黑线A)指示高 样品纯度，并且对于m/z = 341的萃取离子以红线B显示，其与上述痕迹叠加;和(b)3的ESI-MS显示对应于[M+H]+的m/z = 341。
[0037] 图8显示C18反相柱上的（a)MnnHBET(4)和(b)MnniHBET(5)的分析LC-MS痕迹；其中 220nm处的痕迹(黑线A)指示高样品纯度，m/z = 394和393的萃取离子以红线B显示。
[0038] 图9显示（a)MnnHBET(4)在水中的紫外光谱；和（b)MnnHBET(4)的ESI-MS，显示对 应于[M+3H]+的 m/z = 394。
[0039] 图 10 显示（a)MnmHBET(5)在水中的 UV 光谱；和（b)MnmHBET(5)的 ESI-MS，显示对 应于[M+2H]+的 m/z = 393。
[0040] 图 11 显示(a)Na[MnmHBET](5)和(b)Na2[MnnHBET](4)在 TRIS 缓冲液中的弛豫度。 (4) 和(5)的[Μη]在37°C于pH 7.4的TRIS缓冲液中检测。线的斜率表示弛豫度。
[0041 ] 图12显示：包含KN〇3作为支持电解质的内含MnnHBET(25mM)的TRIS缓冲液(pH = 7.4)在50-600mV/s范围内的不同扫描速率下的循环伏安图。
[0042]图13显示:通过375nm处吸光度的下降（点线）检测到的在谷胱甘肽存在下，ΜηΠΙ- HBET向Μηπ-ΗΒΕΤ的转化。实线显示观测数据与Mnm在伪一级条件下的一级速率方程(参见 下方等式S1)的拟合。
[0043]图14显示：在大幅过量的还原的谷胱甘肽的存在下，氧化还原反应表现为对应于 [ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ]的伪一级。各线的斜率等于-k · [GSH](参见下方等式Slha.)谷胱甘肽的浓度 随各反应变化，但ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的初始浓度(0.6mM)不变。b.)初始Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ浓度变化，而谷胱 甘肽浓度(10mM)维持恒定。
[0044] 图15显示：在三种不同的谷胱甘肽浓度下，ΜηΠΙΗΒΕΤ还原的初始速率与Μη ΠΙΗΒΕΤ 浓度的关系图。各线的斜率(ki察)等于-k· [GSH](参见下方等式S1)。
[0045]图16显示:采用还原剂(GSH)和氧化剂(H202)时在两种氧化态之间的相互转化。 [0046]图17显示：（a)图，采用内含ImM H2〇2的TRIS缓冲液(pH 7.4,37°C)，然后进行弛豫 度检测（左轴）和UV-ViS光谱检测的，0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ向ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的氧化，其中375nm处的 紫外吸光度的增加指示随时间（右轴)推移形成Μη ΠΙΗΒΕΤ的变化关系;和(b)图，由LC-MS，通 过ImM H2〇2在26°C监测的0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ。
[0047]图 18显示：内含(a)0.5mM ΜηπΗΒΕΤ和（b)0.5mM ΜηΠΙΗΒΕΤ的TRIS缓冲液(ρΗ=7.4) 的信号强度对比反转时间（ΤΙ)的代表性的图。注意:Μηπ-ΗΒΕΤ的较快信号恢复指示，相较于 ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ具有较短TdP较高弛豫度。
[0048]图19显示本发明的cycHBET系列化合物的合成途径。
[0049] 图20A显示37°C下pH 7·4的内含（a)Na2[MnπHBET](4)和（b)Na[MnΠIHBET](5)的 TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0050] 图20B显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπHBET-0Me](9)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0051 ]图20C显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπHBET-N02](13)和Na[MnΠIHBET-N02](14) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0052] 图20D显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπcycHBET](30)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0053] 图20E显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπcycHBET](2)和Na[MnπcycHBET-N02](25) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0054] 图21显示配体及其对应的锰络合物：（a)HBET、（b)HBET-0Me和（c)HBET-N02的pH-滴定曲线。
[0055] 图22显示：（a)监测的Na2[MnnHBET](4)的UV光谱与pH的关系。（b)288nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 7.64拟合。
[0056] 图23显示：（a)监测的Na2[MnnHBET-0Me](9)的UV光谱与pH的关系。（b)308nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.91拟合。
[0057] 图24显示：（a)监测的1:1Μηπ:ΗΒΕΤ-Ν02的UV光谱与pH的关系。（b)396nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 4.84拟合。
[0058]图 25 显示：对于(a)HBET，（b)HBET-〇Me 和（c)HBET-N02，l:lMn2+:配体滴定的弛豫度 的变化与pH的关系。
[0059] 图26显示：（a)内含Μηπ-ΗΒΕΤ的25mM TRIS缓冲液(ρΗ=7·4)，以500mM KN〇3作为支 持电解质的l〇〇mV/s的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K3Fe(CN) 6<3(b)Mn27Mn3+对-ia(递 减线)和i。(递增线)对比，v(其中v =扫描速率)的科特雷尔图。
[0060] 图27显示(a)监测的Na2[MnncycHBET](20)的UV光谱与pH的关系；和(b)296nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.95拟合。
[0061 ]图 28 显示（a)监测的 Na[Mn(cycHBET-N02)](26)的 UV 光谱与 pH 的关系；和（b)396nm 处的吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的 给定?15.01拟合。
[0062] 图29显示:pH 7.4下的Na2[MnnHBET] (4)的循环伏安图；半电池电位是379mV对比 常规氢电极(NHE)。
[0063] 图30显示：pH 7.4下的Na2[MnnHBET-0Me](9)的循环伏安图；半电池电位是344mV 对比NHE。
[0064] 图31显示：pH 7.4下的Na[Mn(HBET-N02)(14)的循环伏安图；半电池电位是476mV 对比NHE。
[0065] 图32显示:pH 7.4下的Na[Mn(CycBET)](21)的循环伏安图；半电池电位是365mV对 比歷。
[0066] 图33显示：pH 7.4下的Na[Mn(cycHBET-N02)](31)的循环伏安图；半电池电位是 488mV 对比 NHE。
[0067] 图34显示:N-Tos_DTTA( 33)的合成方案。
[0068] 图35显示:pH 7.40下T2与33:Mn2+比例的关系图。
[0069]图36显示:pH触发351-和352-之间的相互转化。
[0070] 图37显示:37°C下20MHz(A)和60MHz(B)下的342-/34卜的^值的pH依赖性。
[0071]图38显示:本发明的Mn(II)螯合剂(40)的合成。
[0072]图39显示:本发明的Mn(II)螯合剂(45)的合成。
[0073]图40显示:本发明的六聚体配体(55)的合成。
[0074]图41的框图是采用本发明的造影剂的示例性磁共振成像(MRI)系统。
[0075] 图42的框图是适用于本发明的造影剂的示例性发射断层摄影系统。
【具体实施方式】
[0076] 对于可用的氧化还原活化的MR探针的一些要求：（1)生物学相关的还原剂(如谷胱 甘肽(GSH))可得到的氧化还原半电池电位；（2)使两种氧化态稳定的配体，从而还原或氧化 不导致分解；（3)活化时的强力信号增强；（4)病理存在下增强的信号变化，即，开启的探针； 和(5)就成像时程而言表现迅速的动力学。
[0077]氧化还原活性探针的一个关键设计特征是：鉴定使两种氧化态稳定的配体。EDTA (乙二胺四乙酸)与一个配位的水共同配体形成非常稳定的7-配位Mn(II)络合物，而2+氧化 态是非常有利的，参见图1。相比之下，如ΗΒΗ)(Ν，Ν'_二(2-羟基苄基)亚乙基二胺-N，N'_二 乙酸)或EHPG(N，Y -亚乙基双[2 (0-羟基苯基）]甘氨酸）中的两个羧酸供体向酚供体的变化 非常有利于具有6号配位的Mn(III)络合物，参见图1。
[0078]我们假设具有配体结构的HBET(羟基苄基亚乙基二胺三乙酸）（图1)(是介于EDTA 和HBED之间的中间体)-仅包含一个酚供体-可能对于各氧化态显示亚稳定性。因此，该物质 的氧