具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid 化合物及其应用。
【背景技术】
[0002]植物内生真菌（fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活与健 康植物各组织合格器官内的真菌。它们与宿主植物通过相互作用形成了紧密的共生关系， 可以促进植物的生长，提供植物应对胁迫的适应能力，有的植物内生真菌还具有药用价值。 从植物内生真菌中寻找和发现活性化合物已成为国内外研究的又一热点，如中国专利文献 CN201310194836.5公开了 一株龙胆中分离得到的内生真菌(]\^七31'1'11丨2；[11111)11)421，可用于 防治龙胆叶枯病;专利申请CN201210067829.4则公开了从银杏根、茎、叶等组织中分离得到 的内生真菌腐皮镰孢菌T-7，对辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、苹果腐烂病菌等具有很好的 抑制作用。
[0003]目前在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减 轻病虫草害，保证农作物丰产丰收起到积极的作用，但是由于自然界生物之间的相互制约 相互依存，现在已不建议过分依赖化学农药在进行病害的处理；因此，对植物内生真菌的研 究，利用植物内生真菌与宿主植物生物活性共生的关系，来筛选具有高生物活性的内生真 菌，进一步获得活性产物，是近年来研究的一大热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物及其抗 细菌活性应用。
[0005] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，是将重寄生拟盘多毛孢菌 株发酵培养后，再经提取与分离后得到的化合物，结构式如下：
[0006]
[0007] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物的制备方法，包括以下工艺 步骤：
[0008] 步骤①:将重寄生拟盘多毛孢菌株用培养基室温下培养10-30天；
[0009] 步骤②:将所述步骤①中培养基连同其上的菌落一同切为块状，然后使用混合溶 剂浸泡提取3次;将3次提取物合并浓缩后，用萃取剂萃取至颜色不再改变，然后用旋转蒸 发仪40_50°C减压浓缩至干得浸膏；
[0010] 步骤③:将所述步骤②中的浸膏用溶剂溶解后再用硅胶拌样，经正相柱层析，然后 用石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱，最后经过TLC层析检测，将含有相同Rf值和 显色情况的化合物组分合并在一起，分别减压浓缩至干，得到10个组分Fr. 1至Fr. 10;
[0011] 步骤④:将所述步骤③中的化合物组分Fr. 1至Fr. 10分别用常规分离或洗脱方法 中的一种或多种组合进行反复分离、洗脱后得到具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合 物，所述常规分离或洗脱方法为以下所列方法：
[0012] (l)Sephadex LH-20分离；
[0013] (2)NP7000型-高效液相色谱仪分离；
[0014] ⑶用硅胶拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱。
[0015] 所述步骤①中培养基的组成（改良M-1-D培养基）：NaH2P〇4.H2〇 20mg，FeCl3 2.0mg，MgS〇4 360mg，KCl 60mg，Ca(N〇3)2 2280mg，KN〇3 80mg，鹿糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸 膏0.5g，MnS〇4 5.0mg，ZnS〇4.7H2〇 2.5mg，H3B〇4 1.4mg，KI 0.7mg，蒸馏水lOOOmL，琼脂 15- 20g，pH自然;所述步骤①中培养基的体积为30L。
[0016]所述步骤①中的重寄生拟盘多毛孢菌株为重寄生拟盘多毛孢菌株cr014。
[0017] 所述步骤②中混合溶剂为乙酸乙酯：甲醇：乙酸=80:15:5 (V/V/V)，萃取剂为乙酸 乙酯。
[0018] 所述用于拌样的硅胶为100-200目，所述步骤③中正相柱层析所用硅胶为200-300 目，石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯为10:1-6:4,氯仿：甲 醇为 20:1-0:100。
[0019] 所述步骤④中Sephadex LH-20分离时所用的洗脱剂为氯仿：甲醇=1:1、甲醇、丙 酮中的一种;所述步骤④中用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱时石油醚:丙酮为8:2-7:3。
[0020] 本发明所述化合物分子结构式(1)到（10)分别对应化合物1到10:
[0021 ] 化合物1:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658)确定其分子式为C19H26〇6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合物7中含有6个季 碳信号（3。197.1、171.4、151.4、133.0、130.3和64.6)，5个次甲基（3。143.3、136.1、127.3、 66.4和59.2)，6个亚甲基（3。55.1、35.2、32.8、31.0、29.8和23.7)和2个甲基（3。14.5和 13.0) 〇
[0022] 根据1H-匪R数据显示：由于具有一个单峰甲基（δΗ1.89, s)和一个三重峰甲基（δ η0.94，t，J = 7.0Hz)，表明化合物1的平面结构与ambuic ac id的类似物相似。由COSY谱中的 数据可以看出该化合物的关键相关点（Η-3/Η-4;Η-11/Η-12/Η-13/Η-14/Η-15/Η-16/Η-17)， 由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-11-C-12-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2 个 片段。该化合物详细的结构由2D-NMR确定，根据HMBC上的数据显示:3位烯基的质子δΗ 6.84 (!1-3)与3。171.4(〇1)，133.0((：-2)，31.0((：-4)，64.6((：-5)和13.0((：-18)相关，18位甲基上 的质子知 1.89(Η-18)与 δ。171.4((：-1)，133.0((：-2)和136.1((：-3)相关;4位亚甲基上的质 子3 113.18和2.74(!1-4)与5。133.0((：-2)，136.1((：-3)，64.6((：-5)和59.2((：-10)相关 ；6位的 质子δΗ 4·85(Η-6)与151.4(〇7)，130.3(〇8)，127.3((：-11)和31.0((：-4)相关；19位的质 子δ Η 4.49和4·28(Η-19)与δ。197.1(C-9)，151.4(C-7)和 130.3(C-4)相关。通过结合其他 相关点，可以推断出该化合物的平面结构。
[0023] 化合物1的相对构型由N0ESY实验确定，Ν0Ε数据显示:H-4、H-6和H-10相关确定了 对应C-5、C-6和C-10构型，并且从1Η-NMR计算出H-11和H-12的耦合常数为15.9Hz，揭示了位 于C-11的双键是E构型，由此得出了化合物1的相对构型，并将其命名为pestalotic acid A〇
[0024] 化合物2:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658;calc.345.1338)确定其分子式为C19H22O6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合 物2中含有 9 个季碳信号（δ。169.1、162.1、148.5、148.1、140.8、129.7、122.6、119.2和 110.7)，3个次甲基（3。195.0、138.5和100.4)，5个亚甲基（3。32.1、29.1、28.2、24.9和 23.1) 和2个甲基0。14.3和12.7)。
[0025] 表1化合物1-9的碳谱数据
[0027] a核磁数据在⑶30D中获得.
[0028] b核磁数据在⑶3C0⑶3获得
[0029] 由1H_NMR、13C匪R和DEPT谱数据可以看出化合物2是ambuic acid的类似物，区别 在于ambuic acid中的6元环在该化合物中变为了苯环。由COSY谱中的数据可以看出该化合 物的关键相关点(H-3/H-4;H-13/H-14/H-15/H-16/H-17)，由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2个片段。该化合物的细微结构由2D-NMR确定，根 据HMBC谱的数据可以看出苯环上连接有3个羟基、1个醛基和1个异戊烯基基团；3位烯基的 质子δ Η 6·96(H-3)与δ。169.1(01)，129.7(02) ,24.9(04)，119.2(C-5) (w)和 12.7(018) 相关，18位甲基上的质子δΗ 2.06(H-18)与δ。169.1(〇1)，129.7(〇2)和138.5.0((：-3)相 关；4位亚甲基上的质子δ Η 3·87(Η-4)与5。169.1(01)，129.7(02)，138.5((：-3)，119.2((：- 5)，148.1((：-6)和140.8((：-10)相关；11位烯基的质子5116.97(!1-11)与心148.1((：-6)， 122.6(07) ,162.1(12)和29.1(013)相关；13位的质子5(12.84(!1-13)与心 l〇〇.4(C-ll)， 162.1(〇12)，28.2(〇14)和32.1(〇15)相关；19位醛基上的质子5( 110.34(!1-19)与3。 148.1(06)，122.6(07)，110.7(08)，148.5(09)和 140.8(010)相关。
[0030] 最后用化合物的总不饱和度除了双键、两个酮基以及苯环的不饱和度外，还有一 个不饱和度，暗示了还有一个额外的环状结构在该化合物的骨架上:该环是C-6和C-12通过 氧桥连接形成的。基于上述数据可以推断出化合物2的结构，最后将其命名为pestalotic acid B〇
[0031 ] 化合物3 :褐色油状，结合13C匪R和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+Na]+m/z 379.1284)确定其分子式为C18H2535C105，并从化合物3的ESI-MS的实验数据中可以观察到化 合物3的分子量中有一个为m/z 381[M+2+Na] +同位素峰，其丰度为另一个同位素峰m/z 379 [M+Na]+的三分之一，因此可以判定化合物3中含有一个Cl原子取代基。
[0032]化合物3在HMBC和COSY谱上的关键相关点和化合物1的几乎一样，除了化合物3中 少了一个化学位移为知55.1的碳，以及在6元环上多了一个C1原子取代基。在化合物3中，6 位的质子δΗ 4·43(Η-6)与δ。156.1(07)，lSO.SCC-llhWlSCCDjg.TKDjO.iKC- iO) 和 36.9(C-4) 相关， 18 位烯基上的质子