一种具有极酸性pH响应的近红外荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物荧光分析技术领域，具体涉及一种具有极酸性pH响应的近红外荧 光探针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 细胞内的pH在酶活性、细胞增殖和调亡、抗药性、离子传输、细胞内吞作用以及肌 肉收缩等一系列组织活动中起着至关重要的作用。pH值的微小变化就有可能导致细胞功能 紊乱，引起癌症和阿尔茨海默病等疾病。酸性和碱性过强会导致心、肺病变或神经类疾病， 严重时甚至会有生命危险。在正常的生理条件下，细胞液中H+的浓度约为7.40,其变动幅度 一般在0.1-0.2个pH单位。而一些酸性细胞器，如溶酶体的pH值范围为4.5-5.5。极度酸性环 境(pH〈4)对大多数生物体是致命的。细胞内pH值与细胞功能的密切关系意味着对细胞内pH 值的精确测量可以为研究小至单个细胞器的生理学和病理学过程提供关键信息。因此，如 何精确地检测细胞内pH值的变化显得非常重要。
[0003] 相比于其他pH的测定方法，使用荧光探针法进行pH检测具有灵敏度高、选择性好 等优点，但目前大部分pH探针波长较短，不能避开组织自吸收和自荧光，背景干扰较强，部 分stocks位移小，紫外吸收波谱和荧光光谱重叠较大，信噪比低，毒性较大，不能用于细胞 和活体pH检测。而近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600~900nm，可避免背景 干扰。因此，近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。
[0004] 目前报道的许多pH荧光探针集中在检测细胞内中性，即细胞液的pH值以及溶酶体 和内涵体等酸性细胞器pH值。测定极度环境，如pH〈5或pH>9的荧光探针报道的非常少。因 此，设计合成具有大的Stokes位移、背景干扰少、能测定极度环境下pH的荧光探针具有非常 重要的意义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种具有极酸性pH响应的近红外荧光探针及其制备方法 和应用。所述具有极酸性pH响应的近红外荧光探针的stocks位移较大、背景干扰少，对H+有 较高的灵敏度、高选择性，对细胞和活体伤害较小，且pKa较低，很适合用来进行极酸环境下 (pH〈4.0)ρΗ的检测，该探针在结合H+前后颜色变化较明显，可方便地通过裸眼识别。
[0006] 本发明第一方面提供了一种具有极酸性pH响应的近红外荧光探针，其化学结构式 如式(I)所示：
[0008] 式（I)中，X为-C(CH3)2-、-〇-、-S-或-Se-，z为-CH2-Ph或以-R'NH 2所示的基团，其 中，R '为Ci-12的亚烷基，RjPR2分别独立地选自Η原子、Ci-18烷基或以-S0 3R5所示的基团，其 中，Rs为18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自 18烷基或苄基，Y为F、C1、Br或I 〇
[0009] 优选地，所述Z为-CH2-Ph或-CH2CH2NH 2。当所述R '为亚乙基时，所述Z为-CH2CH2NH2。
[0010] 优选地，所述X为-c(ch3)2-。
[0011] 优选地，所述Ri和所述R2均为Η原子。
[0012] 优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
[0013] 优选地，所述Y为I。
[0014] 进一步优选地，所述X为-C(CH3 )2-，所述Ri和所述R2均为Η原子，所述R3和所述R4均 为乙基，所述Y为I。
[0015]所述具有极酸性pH响应的近红外荧光探针，以近红外花菁类荧光染料
为母体，在中位上分别修饰上对H+敏感的供体分子
(尺'为心七的亚烷基），在光激发下会产生从电子给体向受体荧光团的电荷 转移，在酸性条件下，H+与供体结合，促进了分子内电荷转移，增加了体系的共辄程度，电子 流动性增加，吸收光谱红移。在PH3.5~7.5时，其在激发光760nm、670nm下发射波长790nm处 的荧光强度比（简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强。
[0016]所述具有极酸性pH响应的近红外荧光探针的最大吸收波长随着pH降低由670nm红 移到760nm，能有效避开组织自吸收和自焚光，其最大发射波长为790nm-800nm，stocks位移 高达130nm，背景干扰少、信噪比较高。同时毒性较小，对细胞和活体伤害较小。另外，所述探 针的pKa在4左右，由于所述探针带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测细 胞内pH。
[0017] 本发明第一方面提供的所述具有极酸性pH响应的近红外荧光探针，具有较低的 pKa值，对H+有较高的灵敏度、高选择性、stocks位移较大、背景干扰小，对细胞和活体伤害 较小，很适合用来进行极酸环境下pH的检测(其中，极酸是指pH〈4.0)，克服了现有技术荧光 探针的缺陷。而且该探针在结合H+前后颜色变化较明显，可方便地通过裸眼识别。
[0018] 本发明第二方面提供了一种具有极酸性pH响应的近红外荧光探针的制备方法，包 括以下步骤：
[0019] (1)分别提供化学结构式如式（Π )所示的化合物和第一化合物，所述第一化合物 的结构式如（ΙΠ )或式(IV)所示：
[0021 ] 式（Π )中，X为-c(CH3) 2-、-0-、-S-或-Se-，心和办分别独立地选自Η原子、Ci-18烷基 或以-S03R5所示的基团，其中，烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自CK8烷基或苄 基，Y为F、Cl、Br或I;式(IV)中，R'为 12的亚烷基；
[0022] (2)将式（Π )所示的化合与所述第一化合物按照摩尔比为1: (3-6)的比例溶解在 溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在50_70°C反应下l_5h，提纯后得到具有极酸性pH 响应的近红外荧光探针，所述具有极酸性pH响应的近红外荧光探针的化学结构式如式（I) 所示：
[0024]式（I)中，X为-C(CH3)2-、-〇-、-S-或-Se_，Z为-CH 2_Ph或以-R'NH2所示的基团，其 中，R '为Ci-12的亚烷基，RjPR2分别独立地选自Η原子、Ci-18烷基或以-S0 3R5所示的基团，其 中，Rs为18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自 18烷基或苄基，Y为F、C1、Br或I 〇 [0025]优选地，所述 Z 为-CH2_Ph 或-CH2CH2NH2。
[0026] 优选地，所述X为-C(CH3)2-。
[0027] 优选地，所述和所述R2均为Η原子。
[0028] 优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
[0029] 优选地，所述Y为I。
[0030] 进一步优选地，所述X为-C(CH3)2-，所述R!和所述R2均为Η原子，所述R 3和所述R4均 为乙基，所述Y为I。
[0031]步骤(2)的反应方程式为：
[0035] 优选地，所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
[0036] 优选地，所述缚酸剂为三乙胺、N，N_二异丙基乙胺(DIPEA)或吡啶。
[0037] 优选地，所述缚酸剂与所述化学结构式如式（Π )的化合物的摩尔比为(2-4): 1。
[0038] 优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
[0039] 优选地，所述提纯的方法包括：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶 柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱以除去溶剂，得到所述具有极酸性pH响应 的近红外荧光探针。
[0040] 更优选地，所述梯度洗脱中，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比从30:1到10:1进 行变化。
[0041] 进一步优选地，当所述第一化合物的结构式如(IV)所示时，所述提纯还包括：
[0042]在所述进行梯度洗脱后，采用乙腈和乙二胺的混合溶剂来脱去Fmoc。
[0043]优选地，所述化学结构式（Π )所示的化合物采用以下方法制得：
[0045] 式（V)中，X为-C(CH3)2-、-〇-、-
[0044] 提供化学结构式如式（V )所示的化合物：
，： S-或-Se-，RjPR2分别独立地选自Η原子、&-18烷基或以-S03R 5所示的基团，其中，1?5为&-18烷 基或苄基，R3和R4分别独立地选自&-18烷基或苄基，Y为F、C1、Br或I;
[0046] 将化学式如（V)所示的化合物和
按摩尔比为1:(3-6)的比例溶解在第二溶 剂中，保护气体氛围下，在60°C_80°C进行反应l_2h，提纯后制得化学式如式（Π )所示的化 合物。
[0047]更优选地，所述第二溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
[0048] 更优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
[0049] 更优选地，所述提纯的方法为：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶 柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得化学结构式如式（Π )所示 的化合物。
[0050] 进一步优选地，所述梯度洗脱中，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比从40:1到20: 1进行变化。
[0051] 本发明第二方面提供的一种具有极酸性pH响应的近红外荧光探针的制备方法，该 制备方法简单易操作。
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