用于治疗黑色素瘤的柠檬苦素化合物及其制备方法

文档序号:9742509阅读:449来源:国知局
用于治疗黑色素瘤的柠檬苦素化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域,具体涉及从九里香的干燥根皮中分离得到的一种柠檬 苦素类化合物,含其的药物组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 九里香Murraya exotica L.为芸香科九里香属植物,主要分布在我国云南、贵州、 湖南、广东、广西、福建、海南、台湾等省区,以及亚洲一些热带及亚热带地区,其气香,味苦、 辛,有麻舌感,具有行气止痛、活血散瘀之功效,用于胃痛、风湿痹痛,也用于治疗牙痛、跌扑 肿痛、虫蛇咬伤。很早以前,我国南方就将九里香作为一种民间用药,用于治疗各种病症,特 别是炎性病变和镇痛。
[0003]近年来,中外学者对九里香的化学成分进行了大量研究,从其叶、根皮、果实等部 位中分离得到了多种化合物,主要包括香豆素类、黄酮类、生物碱类以及挥发油等。九里香 含有大量的香豆素类成分,这类成分的常见特征为在7-甲氧基或5,7_二甲氧基香豆素骨架 的C8位带有异戊二烯单位,以氧化、酯化或骨架重排等多种形式存在。九里香含有多种黄酮 类化合物,还含有黄酮苷类成分。九里香的叶中含有大量的黄酮类和香豆素类化合物,而九 里香的根、皮中主要含有生物碱类成分。挥发油类是九里香的主要化学成分之一。其挥发油 成分的含量因品种、采收季节、地区不同而存在差异,含量的高低影响九里香的药材质量及 临床疗效。
[0004] 现代药理研究表明九里香具有杀虫、消炎镇痛、抗菌及抗氧化等作用。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种从九里香的干燥根皮中分离得到的一种柠檬苦素类化 合物,含其的药物组合物及其制备方法和应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
[0007] 具有下述结构式的化合物(I):
[0009]所述的化合物(I)的制备方法,包含以下操作步骤:(a)将九里香的干燥根皮粉碎, 用70~80 %乙醇热回流提取,合并提取液,浓缩至无醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱 和的正丁醇萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;(b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂,先用10%乙醇洗脱6个柱体积,再用70%乙醇洗脱8个柱 体积,收集70 %洗脱液,减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物;(c)步骤(b)中70 %乙醇洗脱浓缩 物用正相硅胶分离,依次用体积比为90:1、60:1、35 :1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分;(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1、15:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离,用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱,收集8~12个柱体积洗脱液, 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地,步骤(a)中,用75%乙醇热回流提取,合并提取液。
[0011] 进一步地,所述大孔树脂为DlOl型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物,其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时,可以直接使用,或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(I),其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时,可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时,可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式;
[0019] 图2为化合物(I)计算E⑶和实验E⑶图;
[0020]图3为BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022] 主要材料、试剂来源及仪器类型:
[0023]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限 公司,甲醇,分析纯,购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0025] (a)九里香的干燥根皮(IOkg)粉碎,用75 %乙醇热回流提取(30L X 3次),合并提取 液,浓缩至无醇味(6L),依次用石油醚(6L X 3次)、乙酸乙酯(6L X 3次)和水饱和的正丁醇 (6LX3次)萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物;(b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用DlOl大孔树脂除杂,先用10%乙醇洗脱6个柱体积,再用70%乙醇 洗脱8个柱体积,收集70 %洗脱液,减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物(125g); (c)步骤(b)中 70 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离,依次用体积比为90:1 (8个柱体积)、60 :1 (8个柱体 积)、35:1 (8个柱体积)、15:1 (10个柱体积)和1:1 (6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分;(d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1(8个柱 体积)、15:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;(e)步 骤(d)中组分2(15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为70 %的甲醇 水溶液等度洗脱,收集8~12个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (151mg)〇
[0026] 结构确证:白色无定形粉末;HR-ESIMS显示[Μ+Na]+为m/z 621.1910,结合核磁特 征可得分子式为C31H34O12,不饱和度为15。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρηι,DMS0_d6,400MHz):H-3 (4.85,s),H-5(2.80,s),H-6(4.19,s),H-ll(6.27,s),H-14(1.73,dd,J=11.8,7.4),H-15 (2.63,dd,J=18.8,7.4),H-15(2.76,dd,J=18.8,11.8),H-17(5.05,s),H-18(0.96,s),H-19(1.39,s),H-21(7.26,br,s),H-22(6.17,br,s),H-23(7.34,t,J=1.7),H-28(0.98,s), H-29(0.71,s),H-30(2.63,s),H-2'(5.83,dq,J=15.5,1.7),H-3'(7.07,dq,J=15.5, 7.0),H-4'(1.94,dd,J = 7.0,1.7),7-0CH3(3.83,s),6-OH(3.00,s);核磁共振碳谱数据 (ppm, DMSO-de ,100MHz) :208.7(C,1-C) ,78.2(C, 2-0,85.1 (CH, 3-0,39.2(C, 4-0,50.0 (CH,5-C),68.7(CH,6-C),175.2(C,7-C),73.3(C,8-C),136.8(C,9-C),51.6(C,10-C), 125.7(CH,n-C),202.7(C,12-C),58.3(C,13-C),37.6(CH,14-C),28.3(CH2,15-C),168.6 (C,16-C),81.7(CH,17-C),22.8(CH 3,18-C),14.6(CH3,19-C),121.4(C,20-C),139.9(CH, 21-C),108.7(CH,22-C),143.2(CH,23-C),21.2(CH 3,28-C),21.7(CH3,29-C),63.8(CH,30-C),164.2(C,1'-C),120.7(CH,2'-C),147.0(CH,3'-C),18.1(CH 3,4'-C),52.8(CH3,7-OCH3);碳原子标记参见图I。红外光谱显示该化合物含有羟基和羰基基团(3454CHT 1和 1736CHT1)。1H和13CNMR数据的分析表明该化合物为柠檬苦素结构,包含四个叔甲基,一个甲 氧基,一个三取代双键,一个三取代的环氧乙烷,两个酮羰基,两个酯羰基,一个2-丁烯酸乙 酯结构以及一个β-单取代呋喃环。HMBC谱中,]\^-19〇!11.39,8)和!1-3〇0!12.63,8)与(:-1(5 C208.7)的相关性表明C-I为酮羰基。两个含氧碳信号(SC78.2,2-C;63.8,30-C)以及质子信 号(δΗ2.63,s,Η-30)表明该化合物含有一个30,2-环氧基团。此外,2-丁烯酸乙酯结构与C-3 0〇85.1)位相连;腿8(:谱中,!1-3(3!14.85,8),!1-2'(3!15.83,(^,了=15.5,1.7!^)和!1-3'(5 !17.〇7,(^,1=15.5,7.〇抱)与(:-1'0(:164.2)的相关性验证了上述推论。!1-2'和!1-3'之间的 耦合常数(J = 15.5Hz)表明2-丁烯酸乙酯结构为E构型。HMBC谱中,-OCH3(δΗ3.83,s)与C-7 0(:175.2),!1-60!14.19,8)与(:-50〇5〇.〇)和(:-7的相关性表明(:-60〇68.7)连有一个甲氧 羰基片段。此外,6-OH(3.00,s)与C-5,C-6和C-7的相关性表明C-6位还连有一个羟基。根据 HMBC 谱中 H-170H5.O5,s)与 〇2〇0(:121.4),(:-210(:139.9)和(:-22(5(:1〇8.7)的相关性,可 推断呋喃环位于C-17位上。ROESY谱中,H-5与Me-29,以及H-5与H-17的相关性表明它们为β 构型。此外,Η-14与Me-18的交叉峰表明Me-18和Η-14是α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和 ROESY谱,以及文献关于相关类型核磁数据,可基本确定该化合物如图1所示,立体构型进一 步通过E⑶试验确定,理论值与实验值基本一致(图2)。
[0027]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0028] -、材料和仪器
[0029] 人Α375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物(I)自制,制备方法见实施例1, HPLC归一化纯度大于98% JMEM培养基、0.25%胰酶购自美国Gibco公司。ΜΤΤ(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐;四甲基偶氮唑蓝)、DMS0(二甲基亚砜)、BrdU购自美国 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠二抗购自美国Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
[0030] 恒温CO2培养箱,普通冰箱,-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台(中国 苏州净化工程公司)。倒置显微镜,倒置荧光显微镜(Olympus公司)。电热恒温培养箱(中国 上海跃进医疗器械厂)。自动酶标仪(日本Wako公司)。紫外分光光度仪(美国Beckman公司)。 J6-HC高速离心机(美国Beckman公司)。低温微量离心机(德国Eppendorf公司)。振荡摇床 (美国Forma公司)。
[0031]二、试验方法 [0032] 1、细胞培养
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