一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类多肽序列分析方法的建立，尤其是一种肠道可吸收乳清肽序列分 析方法的建立。
【背景技术】
[0002] 乳清蛋白是干酪以及干酪素生产过程中的副产物，其含量占牛乳中蛋白质含量的 18%~20%。利用蛋白酶水解乳清蛋白制备生物活性肽是目前乳清开发的一个方向。生物 活性肽是一类具有生理活性寡肽的统称，现已发现乳清蛋白来源的生物活性肽有降血压 肽、促矿物元素吸收肽、吗啡肽等。这些生物活性肽在被吸收进入人体后能发挥生理调节活 性，因此，乳蛋白来源的生物活性肽有着巨大的开发应用前景。
[0003] 然而，生物活性肽口服吸收生物利用度低是限制其发展的主要因素，小肠是物质 吸收的主要场所，也是生物活性肽吸收的主要屏障，活性肽经人体口服后，要以完整形式穿 越小肠上皮细胞进入人体体液循环，才能达到生物学功效。目前研究认为，多肽能否以完整 形式由小肠转运至血液，与多肽链长度、肽的氨基酸组成、亲疏水性、带电性均有一定关系， 但现在还没有完全定论，如现在普遍认为二肽和三肽能完整的吸收，三肽以上的多肽能否 完整吸收还存在争议。因此，大于三肽的生物活性肽也可能不被小肠吸收，但是现在还没有 明确的方法来研究能够被小肠完整吸收多肽的序列特征。
[0004] Caco-2细胞模型于20世纪70年代首次分离自人类结、直肠癌细胞，培养成熟的 Caco-2细胞即可形成与人体小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织，其形态 和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(apical，肠腔侧，又称 黏膜剂)和基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧，又称浆膜剂KAP侧含有典型的小肠微绒毛 水解酶和各种营养物质的转运载体，Caco-2细胞现已被广泛用于药物口服吸收的体外筛选 模型。目前关于利用Caco-2细胞进行活性肽的转运实验只是合成某一种生物活性肽然后进 行肠道转运实验，评价其吸收状况及转运机制，并无利用Caco-2细胞模型研究肠道可吸收 乳清肽的序列的方法。
[0005] 因此，本发明建立了一种以Caco-2细胞模型，分析肠道可吸收乳清肽序列的方法， 该方法了解到能够由完整形式顺利由小肠转运至血液的多肽结构特征后，能更具针对性地 筛选口服吸收生物利用度高的生物活性肽。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种肠道可吸收乳清肽序列的分析方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:a)利用具有特异性酶切位点的蛋 白酶水解乳清蛋白；b)水解结束后酶解液加热灭酶活，离心取上清液为粗乳清肽(A) ;c)步 骤b)中的粗乳清肽(A)用截留分子量为1000 ODa的中空纤维超滤膜超滤，得到乳清肽超滤液 (B )，冷冻干燥备用;d)步骤c)中的乳清肽超滤液(B)用蒸馏水溶解后，经过Sephadex G-10 凝胶过滤层析，收集各个分离组分得到纯化乳清肽(C)，冷冻干燥备用;e)构建Caco-2细胞 转运模型;f)步骤d)中分离得到的纯化乳清肽(C)进行Caco-2细胞转运实验，收集Caco-2细 胞基底侧转运乳清肽(D) ;g)步骤f)中Caco-2细胞基底侧(BL侧)转运乳清肽(D)用UPLC-MS 分析肽序列。
[0008]步骤a)具体包括以下步骤：
[0009] al)乳清浓缩蛋白粉WPC-80溶于蒸馏水，质量浓度为6%，在65°C下恒温加热15~ 30min，使其充分溶解；
[0010] a2)乳清蛋白溶液溶解后降至各具有特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，调 节乳清蛋白溶液PH至各具有特异性酶切位点的蛋白酶最适水解pH值，分别加入具有特异性 酶切位点的蛋白酶进行水解，添加的各具有特异性酶切位点的蛋白酶量与乳清蛋白粉比为 3%(W/W)，酶解时间为2h。
[0011] 特异性酶切位点的蛋白酶包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。
[0012] 特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，碱性蛋白酶的最适酶解温度为55°C，胰 蛋白酶的最适酶解温度为45°C，糜蛋白酶的最适酶解温度为50°C，所述的具有特异性酶切 位点的蛋白酶酶解最适pH，碱性蛋白酶的最适酶解pH为8.5，胰蛋白酶的最适酶解pH为7.5， 糜蛋白酶的最适酶解pH为8.5。
[0013] 步骤c)中空纤维超滤膜截留分子量为1000 ODa，超滤膜压力为0.1-0.4Mpa，流速为 5_10mL/min〇
[0014] 步骤d)凝胶过滤层析为Sephadex G-IO，上样体积为2.5mL，上样质量浓度为30mg/ mL，蒸馏水为洗脱液，洗脱速度为2mL/min。
[0015]步骤e)具体包括以下步骤：
[0016] el )Cac〇-2细胞用含10%胎牛血清的、含青霉素80U/mL、链霉素0 · 08mg/mL的DMEM 培养液，37°C，5 % C〇2培养箱，隔天换一次培养液，直至下一次传代；
[0017] e2)用DMEM培养液制成细胞悬液，以密度2X105cells/mL接种于12孔Transwell板 的滤I旲上；
[0018] e3) 24h后换培养液，前7天隔天换液，之后每天换液，培养21天；
[0019] e 4 ) 2 1天后测定C a c 〇 - 2细胞模型的各评价指标，跨上皮细胞电阻 (transepithelium electrical resistance，TEER)，碱性磷酸酶活力，焚光素钠渗漏实验。
[0020] 步骤f)用HANKS缓冲液清洗Caco-2细胞，在绒毛面AP侧加入由HANKS缓冲液配制的 纯化乳清肽(C) 0.5mL，乳清肽(C)质量浓度为IOmg/mL，在BL侧加入HANKS缓冲液1.5mL，置于 37°C，5%C02培养箱中转运Ih，转运结束后，BL侧取出转运乳清肽(D)，经0.22μπι的水系滤膜 过滤后冷冻干燥。
[0021] 纯化乳清肽（C)包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶酶解乳清蛋白后经超滤、 Sephadex G-10分离后组分。
[0022] 步骤g)所述超高效液相质谱联用仪(UPLC-MS)采用的是液相色谱串联四级杆飞行 时间质谱仪，分析条件如下：
[0023] gl)液相色谱分析柱为ACQUITY UPLC BEH130C18柱（2.1\15〇11111，1.7以111)，流动相八 为100 %乙腈，流动相B为0.1 %甲酸，柱温45°C，检测波长204nm，流速0.3mL/min，进样量8μ L；
[0024] g2)质谱条件为干燥气和雾化气Ν2,离子方式ESI+，毛细管电压3.5kVolts，锥孔电 压30V〇1 ts，脱溶剂气体温度300°C，离子源温度100°C，脱溶剂气体流量5001 i t/hr，锥孔气 体流量(17!^)501丨以1^，碰撞能量6/35￥〇^8，质量范围100~1500111/2，检测电压1600~ 1700Volts〇
[0025] 本发明的有益效果体现在：
[0026] (1)多肽肽链长度、多肽N端和C端的氨基酸组成等会影响多肽小肠的完整吸收。因 此，本发明利用具有特异性酶切位点的蛋白酶，包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分别 酶解乳清蛋白，水解液而后通过超滤、Sephadex G-IO凝胶过滤层析进行分离，可制备获得 酶切位点、分子量、亲疏水性和静电荷各不相同的乳清肽。
[0027] (2)本发明以Caco-2细胞为肠道吸收模型将各蛋白酶酶解制备所得的乳清肽进行 肠道转运实验，Caco-2细胞是一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体 外筛选工具，在本发明中，Caco-2细胞用于肠道可吸收乳清肽的生物分离，通过Caco-2细胞 分离纯化得到肠道完整吸收的多肽。
[0028] (3)本分明使用的超高效液相质谱联用仪UPLC-MS分析鉴定转运出乳清肽氨基酸 序列，分辨率高。本发明研究发现，能由肠道完全转运的乳清肽多为五肽以下的小分子多 肽，其中二肽数量最多，其次为三肽和四肽，五肽数量很少；中性肽，疏水性较强的多肽能够 较好地由小肠顺利转运。
[0029] (4)多肽口服利用度低，肠道不能完整吸收是多肽产业化应用的关键问题，也是多 肽应用于功能性食品市场和药品市场的当务之急。该方法建立了一套利用Caco-2细胞吸收 模型分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，该发明也可以分析其它肠道可吸收多肽的序列， 而后通过构建模拟酶切多肽库，控制水解度等方式得到口服吸收利用度高的多肽，或进行 生物活性肽的结构设计，可拓展乳、功能性食品及新药开发的领域，对人类健康事业的发展 具有较大的促进作用。
【附图说明】
[0030] 图1为利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法步骤；
[0031] 图2为碱性蛋白酶酶解乳清蛋白水解物经G-IO分离后的峰1(样品1)的总离子流图 (TIC)图；
[0032] 图3为碱性蛋白酶酶解乳清蛋白水解物经G-IO分离后的峰2(样品2)的总离子流图 TIC 图；
[0033] 图4为胰蛋白酶酶解乳清蛋白水解物经G