一种具有dpp-iv抑制活性的多肽及其在降血糖药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽GPVGXAGPPGK在制备抑制二肽基肽酶一IV(DPP-IV)及降血糖中 的应用。
【背景技术】
[0002] 二肤基肤酶一IV (dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV) (EC3. 4. 14. 5)是一种丝氨 酸蛋白酶，广泛分布于人体内。DPP-IV通过对多肽的剪切使其失活，从而达到调节生理功能 的作用。DPP-IV优先水解N-末端第二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白质。 其作用底物包括：胰高血糖素样肽-I (GLP217-36)、抑胃肽（GIP1-42)、神经肽（NPY)、YY肽 (PYY)以及胰多肽家族（PP-family)等。这些物质的共同特点就是N-末端第二位的氨基酸 残基或者是脯氨酸或者是丙氨酸残基。DPP-IV通过作用于以上多肽底物而在糖尿病、葡萄 糖耐量、肥胖、食欲调节、高血脂症、骨质疏松、神经肽新陈代谢和T-细胞激活等相关疾病 中起着重要的作用。因此，体内给予DPP-IV抑制剂可预防相关底物肽的N-末端降解，从而 保障人体机能正常运行。
[0003] DPP-IV将完整的GLP-I和GIP反应切断N-末端2个氨基酸残基后，使其失活从而 影响GLP-I和GIP相关的血糖调节等生理反应。体内给予DPP-IV抑制剂可预防GLP-I和 GIP的N-末端降解，使胰岛素分泌物增加从而改善葡萄糖耐量。鉴于DPP-IV抑制剂与血糖 代谢的密切关系，DPP-IV抑制剂已成为新型2型糖尿病药物的研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供多肽GPVGXAGPPGK在抑制DPP-IV活性和降血糖中的应用；多 肽GPVGXAGPPGK具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作为糖尿病、心脏病、心血管病、肥胖 症、肾病、免疫紊乱等疾病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
[0005] 为实现上述目的，本发明以所述多肽GPVGXAGPPGK为抑制DPP-IV活性和降血糖的 有效成份。
[0006] 其具有序列表SEQ ID NO : 1中氨基酸序列；多肽GPVGXAGPPGK为DPP-IV抑制剂及 降血糖药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
[0007] 具有抑制DPP-IV活性和降血糖活性的多肽化合物GPVGXAGPPGK的氨基酸序列为 Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。单链线性结构，分子量为 949. IDa，白色 粉末状，易溶于水，对DPP-IV活性具有很强的抑制作用，IC5。为83. 45 μ M。
[0008] 多肽GPVGXAGPPGK具备DPP-IV抑制剂所要求的特征=DPP-IV优先水解N-末端第 二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白质或肽，GPVGXAGPPGK的N-末端第二位上 是脯氨酸（Pro)。
[0009] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0010] 本发明首次从鹿皮中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制 DPP-IV的活性，因此作为糖尿病、心脏病、心血管病、肥胖症、肾病、免疫紊乱等疾病的保健 品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1多肽GPVGXAGPPGK的制备
[0012] 100g新鲜的梅花鹿鹿皮，用质量浓度10% NaOH于50°C煮30分钟进行脱脂处理 后，纯水清洗干净，剪为2~3平方厘米的碎片。鹿皮碎片按照1:80 (原料：缓冲液质量比） 加入0.0 lM醋酸缓冲液，再按1:100(酶：原料）质量比加入胃蛋白酶，于40°C搅拌反应1 小时。将上述反应液的pH用IM NaOH调至7,加入复合酶（胰蛋白酶，碱性蛋白酶，质量混 合比例1:1)进行酶解，加酶量为反应物质量的0. 1%，于40°C搅拌反应1小时，反应结束后 90°C灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，上述酶解产物经制备色谱分 离，色谱柱为C18 (20X250mm，10 μ m)，所用的流动相A为质量浓度0. 1 %甲酸/水溶液，流 动相B为质量浓度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速为2mL/min，洗脱过程如下：5% B - 35% B(V/V) - 80% B(V/V)。将在280nm下所检测到的色谱峰分别收集得到不同组分冷冻干燥， 为乳白色粉末状样品。
[0013] 所得样品分别经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS)分析：将冷冻干燥后 的酶解样品用体积浓度〇. 1 %甲酸溶液配制为〇. 4 μ g/ μ L，进样20 μ L进行LTQ线性离子 阱质谱（配置纳升级电喷雾源）分析。利用Xcalibur软件（Thermo)进行系统控制和数据 收集。实验得到的质谱数据结果分别在honeybee, Brassica campestris L.蛋白质数据库 (http://www. uniprot. org/)中进行检索，技术重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获 得序列为 Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。
[0014] 实施例2多肽GPVGXAGPPGK的DPP-IV抑制活性检测
[0015] ⑴原理
[0016] 采用以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA)为底物的发色底物 法筛选DPP-IV抑制剂，该方法的检测原理为在碱性条件下DPP-IV催化底物 Gly-Pro-p-nitroanilide水解，生成黄色的对硝基苯胺，后者在波长405nm处有特征性吸 收峰，通过酶标仪在405nm处测得的吸光度大小反映酶活性高低。
[0017] ⑵方法
[0018] 样品：将样品溶解于IOOmM的Tris-HCl缓冲液（pH = 8. 0)，配成40mg/mL储备液， 再将储备液稀释成不同的浓度，作为样品溶液。
[0019] 底物：Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 缓冲液（pH = 8. 0)将 Gly-pr〇-p-nitroanilide 配置成 L 59mM 的 Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液。
[0020] 酶：DPP-IV 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 缓冲液（pH = 8. 0)配置成 0· OlU/mL 的 DPP-IV 溶液。
[0021 ] 终止溶液：IM的醋酸一醋酸钠缓冲液（pH = 4. 0)。
[0022] 实验在96孔板中进行，利用酶标仪在405nm检测吸光度。首先将酶、缓冲液及药物 在37°C温度下分别水浴30min，然后将样品（或缓冲液）、底物依次加入96孔板内37°C孵育 10分钟，再加入DPP-IV酶溶液，混匀后于37°C温育60分钟，加入100 μ L IM的醋酸-醋酸 钠缓冲液（pH 4. 0)使反应终止。用酶标仪测定405nm吸光度（OD)。反应总体积为100 μ 1。 实验分为4组，每组设3个复孔。各组分别为：
[0023] 样品组（S组）：样品+酶+底物。
[0024] 样品空白组（SB组）：样品+底物。
[0025] 阴性对照组（C组）：酶+底物。
[0026] 空白组（B组）：底物。
[0027] 具体各组加样品见表1。
[0028] 表1DPP-VI抑制活性实验分组及加样量
[0029]
[0030] 注：（1)表中数字的单位均为μ 1。
[0031] (2)反应总体积为100 μ 1，各组按照表中所列加入反应物后用缓冲液将最终体积 补至100 μ 1。
[0032] (3)抑制率的计算
[0034] (4)检测结果
[0035] 分别用 12. 5 μ g/ml, 25 μ g/ml，50 μ g/ml，100 μ g/ml，250 μ g/ml，500 μ g/ml 的多 肽浓度，按上述方法进行DPP-IV抑制活性检测。结果如下表：
[0038] 经IC5。计算器计算该序列的IC5。为79. 20 μ g/mL，即83. 45 μ M。
【主权项】
1. 具有DPP-IV抑制活性的多肽，其特征在于：所述多肽为GPVGXAGPPGK，具有序列表 SEQ ID NO :1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为，Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly -Pr〇-Pro_Gly-Lys 〇2. -种权利要求1所述多肽在制备DPP-IV抑制剂或降血糖药物中的应用。3. 按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述DPP-IV抑制剂及降血糖药物是以多 肽GPVGXAGPPGK为活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。4. 按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多肽在制备预防和/或治疗糖尿病、 心脏病、心血管病、肥胖症、肾病、免疫紊乱中的一种或二种以上疾病药物和/或保健品中 的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种具有DPP-IV抑制活性的多肽化合物GPVGXAGPPGK，其氨基酸序列为Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。多肽GPVGXAGPPGK具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作为糖尿病、心脏病、心血管病、肥胖症、肾病、免疫紊乱等疾病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
【IPC分类】A61P3/04, A61K38/08, C07K7/06, A61P13/12, A61P37/02, A61P9/00, A61P3/10
【公开号】CN105504011
【申请号】CN201410498388
【发明人】邹汉法, 靳艳, 晏嘉泽
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月24日