可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用
【技术领域】
[0001]本发明是关于可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。
【背景技术】
[0002] 焚光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET)是距离很 近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分 子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在IOnm范围以内时，就会发生一种非放射性的能 量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发 射的荧光却大大增强(敏化荧光）。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在IOnm之内， 一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。荧光共振能量转移技术能够实时监控活细 胞内生物分子的活性和分子之间的相互反应，为研究复杂细胞信号通路提供了高时间和空 间分辨率的有效方法。随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物 大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理 研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
[0003] 在生物光学与分子影像技术领域，科学家们一直在努力寻找高效的可用于光学成 像的基因编码生物传感器。这些基因编码的生物传感器利用荧光共振能量转移技术实时的 监控生物分子的活性和分子之间的相互反应。现在普遍使用的基因编码生物传感器是将青 色和黄色荧光蛋白相融合，以青和黄两种颜色的荧光团相搭配，通过荧光共振能量转移实 时监控生物分子的活性和分子之间的相互作用。但是这种生物传感器有诸多缺陷，主要表 现在以下方面：（1)普通生物传感器中使用的青色和黄色两种荧光蛋白的动态感光范围较 低，所以导致成像灵敏度低，很难对细胞内的一些瞬时和微弱生化反应进行监测。（2)光毒 性大，在检测活的细胞或样品时，对细胞正常的代谢反应和分子相互作用产生较大的负面 影响，导致实验结果出现较大的误差，细胞在长时间成像过程中可能死亡。（3)生物传感器 自发荧光干扰。在细胞中成像时，由于传感器本身不可避免的激发青色荧光蛋白的同时可 激发细胞内一些内源性分子，比如flavin，会出现自发荧光，所以对实验结果也会造成不同 程度的干扰和影响。（4)在激发黄色荧光蛋白时青色荧光蛋白出现光活化。（5)传感器所使 用的荧光蛋白对PH敏感，pH发生少许变化时，荧光蛋白可能会失活，荧光会明显减弱。
[0004] 2012年Lam,A.J.等人开发出来一个GFP-RFP对，两种荧光蛋白分别为Clover和 mRuby2。该荧光蛋白FRET对与普通的CFP-YFP FRET对相比提高了反应的敏感性，降低了成 像时光毒性，与其它的GFP-RFP对相比性质优越，且该方案也已经成功用于活细胞中Zn 2+聚 集和CaMKIIa活性的成像。但是不足之处为Clover的光稳定弱，在光连续照射下容易光漂 白。而mRuby2的光强度也并不高，所以限制了该荧光蛋白FRET对的使用（Lam，A.J.et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.Nat Methods9,1005-1012(2012))。在此将该文献的全部内容并入于本发明中作 为参考文献。
【发明内容】
[0005]本发明主要是为了寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器的荧光蛋 白。
[0006]本发明通过定点突变技术，在现有技术焚光蛋白mRuby2和mClover的基础上进行 氨基酸位点突变，而得到突变的新红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，实现了蛋白光物理学性 质的提尚。
[0007]具体而言，一方面，本发明采用定点突变技术在mRuby2基础上进行定点诱变获得 了本发明的新红色荧光蛋白。本发明的该新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基 酸序列(mRuby 2的氨基酸序列可参见图la)相比，具有以下突变位点:11160111601可以让 突变蛋白相比mRuby2更亮，在mRuby2基础上具有M160I突变的蛋白具有比未突变的mRuby2 较高的光强度。
[0008] 根据本发明的具体实施方案，本发明的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2 的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R，M36E，T38V，K74A，G75D，M105T，C114E， H118N，Q120K，H159D，S171H，S173N，I192V，L202I，M209T，F210Y，H216V，F221Y，A222S，G223N 中的一个或多个的组合。这些突变位点会让蛋白成熟或折叠变好。根据本发明的具体实施 方案，本发明的红色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
[0009] (a)具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白；
[0010] (b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a) 具有相同功能的由（a)衍生的蛋白。其中，所述的"相同功能"是指相比于mRuby 2蛋白光物 理学性质提尚（例如壳度提尚）的功能。
[0011] 根据本发明的一优选具体实施方案，本发明的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列参 见SEQ ID No.2所示(其中，所述的M160I突变位点对应SEQ ID No.2氨基酸序列的第164位， 所述的N33R突变位点对应SEQ ID No.2氨基酸序列的第37位，……，依次类推），本发明中命 名该蛋白为mRuby 3。本发明设计的优选的编码该蛋白mRuby 3的基因序列参见SEQ ID No. 1所示。
[0012] mRuby3的激发光谱和发射光谱的峰值分别在约558nm和592nm处，与mRuby2相比出 现了蓝移。在峰值处的消光系数为WSmir1Cnr1，量子产率为0.45,所以mRuby3的光强度比 mRuby2高出35%，所以它是目前为止最亮的单体红色荧光蛋白。除此之外，mRuby3的光稳定 性很好，在弧光灯的照射下，mRuby3的半衰期为349秒，长于mRuby2的123秒和TagRFP-T的 337秒。在光漂白动力学方面，mRuby3表现出单指数关系，它的解离常数值为4.8，与mRuby2 相比耐酸性相似。mRuby3是目前为止亮度最亮和光稳定最好的红色焚光蛋白
[0013]另一方面，本发明还提供了mRuby3的融合蛋白，例如，所述mRuby3与mClover、 mClover3、mNeonGreen或EGFP的融合蛋白。本发明通过实验证明了mRuby3的融合蛋白能够 准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。mRuby3在哺乳动物细胞系中 所表达的信号强度，比红色焚光蛋白mRuby2、FusionRed和mCherry高出至少100% DmRubyS 是一种比mRuby2更高效的荧光共振能量转移受体。
[0014]另一方面，本发明中同样还对绿色荧光蛋白Clover进行了改造，得到光亮度和光 稳定性有所提升且可以作为mRuby3荧光共振能量转移高效供体的新的绿色荧光蛋白。
[0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明提供的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点:N149Y。
[0016] 根据本发明的优选具体实施方案，本发明的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点:G160S或G160C;
[0017] 根据本发明的优选具体实施方案，本发明的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点:A206K。
[0018] 根据本发明的具体实施方案，本发明提供的新的绿色荧光蛋白，其为选自以下(a) 或(b)的蛋白：
[0019] (a)具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示氨基酸序列的蛋白；
[0020] (b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a) 具有相同功能的由（a)衍生的蛋白。其中，所述的"相同功能"是指相比于Clover蛋白光物理 学性质提尚（例如光稳定性提尚）的功能。
[0021] 在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下突变位点：N149Y。本发明命名该新的绿色荧光蛋白 为Cloverl.5,具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID No.5所示(其中，所述的N149Y突变位点对 应SEQ ID No.5氨基酸序列的第150位）。
[0022] 在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下两个突变位点:N149Y和G160S。本发明命名该新的绿 色荧光蛋白为dCl 〇ver2,具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID如.6所示(其中，所述的附49￥ 突变位点对应SEQ ID No.6氨基酸序列的第150位，所述的G160S突变位点对应SEQ ID No.6 氨基酸序列的第161位）。
[0023] 在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与 Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下三个突变位点:N149Y、G160C和A206K。本发明命名该 新的绿色荧光蛋白为mCl 〇Ver3,具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID No.4所示(其中，所述的 N149Y突变位点对应SEQ ID No.4氨基酸序列的第150位，所述的G160C突变位点对应SEQ ID No.4氨基酸序列的第161位，所述的A206K突变位点对应SEQ ID No.4氨基酸序列的第207 位），本发明设计的优选的编码该蛋白mCl〇ver3的基因序列参见SEQ ID No.3所示。
[0024]本发明的新的绿色荧光蛋白，在体内，dCl〇ver2在亮度归一化情况下光稳定性的 半衰期为98秒，mClover3在体内时在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为80秒，而 Clover只有50秒。
[0025] 另一方面，本发明还提供了所述绿色荧光蛋白的融合蛋白，例如，mCl〇Ver3与 mRuby3的融合蛋白。通过在哺乳动物细胞系中对mClover3系统性地进行测试，证明了 mClover3的融合蛋白能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合， mClo ver3和mNeonGreen相比与mEGFP拥有更高的焚光共振能量转移效率，mClover3_mRuby 3 和 mNeonGreen_mRuby3 的效率也比 Clover_mRuby3 要高，