一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]铁元素是大多数生物有机体进行新陈代谢所必须的元素之一，它在维持细胞生长代谢过程中起到重要的作用。铁蛋白是一类广泛存在于动植物、微生物细胞内的用来维持铁代谢平衡的重要蛋白。
[0003]大肠杆菌铁蛋白结构呈球形，由铁核和蛋白壳两部分组成，前者以氢氧化铁和磷酸盐的形式存在于蛋白壳，后者是由24个亚基单体组成的八面体高度对称性结构。铁蛋白外径12nm，内径约8nm，由于其独特的纳米级立体空间结构，其在药物载体以及纳米结构材料设计等方面已成为研究热点。大肠杆菌铁蛋白的血红素分子存在于二相对称轴的相邻亚基之间，距离蛋白壳外表面10埃，血红素的卟啉环与二相对称轴平行，对称的两个亚基上的Met52从卟啉环两侧与卟啉环的铁配位络合。血红素参与了蛋白的铁存储和释放过程中的电子传递，是细菌铁蛋白的电子隧道组成之一 1^52被认为是大肠杆菌铁蛋白与血红素结合的关键氨基酸位点，但将其突变为丙氨酸且发现其对铁蛋白稳定性影响至今未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系，所得突变体具有可调控的温度稳定性，可作为一种通过小分子诱导控制温度稳定性的蛋白质纳米载体。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0006]一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，其DNA序列如SEQ NO:1所示。
[0007]上述的去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，为定点突变，是将第52位蛋氨酸突变为丙氨酸。
[0008]上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQN0:2所示。
[0009]用于扩增去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体的引物对为:
[0010]上游引物:5，-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3，
[0011 ]下游引物:5 ’ -GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3 ’。
[0012]上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体的纯化方法包括顺序相接的如下步骤:
[0013](I)挑取含重组质粒pET32 Ek/LIC_M52A的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD6qq达到
0.6，30°(3下用终浓度0.5111]\1 IPTG 诱导 3h;
[0014](2)离心收集菌体并洗涤；
[0015](3)用N1-NTA亲和柱纯化:向洗涤后的菌体中加入I XBinding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液通过0.22μπι水系膜过滤后上样，用1mM咪唑洗脱去除杂蛋白，最后用15mM咪唑洗脱液收集目标蛋白洗脱，最后在25°C温度下用2U/yL肠激酶酶切20h，即可获得目标蛋白。
[0016]上述PET32Ek/LIC为载体，M52A为去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体。
[0017]上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体恢复稳定性的化学诱导方法为:将血红素与去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体以摩尔比1:10均匀混合，在25°C下诱导36h。
[0018]大肠杆菌细菌铁蛋白由24个亚基单体组成，该铁蛋白热力学稳定性高(熔点1?为69.9°C)，亚基之间以C4、C3和C2形式高度对称、精密排列，其中处在C2对称性上每两个亚基即存在一个血红素分子，血红素是一种铁卟啉化合物，申请人经研究发现，去除血红素虽然对铁蛋白的自组装没有明显影响，但是对其热稳定性产生较大影响，其Tm值54.3°C远小于野生型铁蛋白1^值69.9°C，且经过氯化血红素与该突变体M52A化学诱导结合后，发现其1?值重新恢复至67.7°C，由此可知，突变体M52A对大肠杆菌铁蛋白稳定性影响很大，且血红素具有调控铁蛋白稳定性的作用。
[0019]一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO:1所示的DNA序列;所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
[0020]本发明未提及的技术均参照现有技术。
[0021]有益效果:与现有技术相比，本发明所提供的去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体(M52A突变体)具有降低蛋白稳定性和可化学诱导重新获得蛋白稳定性的特性，其四级结构并未发生明显变化，仍为球形壳状结构;野生型铁蛋白Tm(50%蛋白质发生变性的温度)为69.9°C，而突变体M52A的Tm仅为54.3°C，与氯化血红素化学诱导后其Tm恢复为67.7°C，因此该突变体具有温度稳定性可调控性；由于铁蛋白已被广泛应用于纳米材料的载体，此突变体M52A不影响蛋白的聚合度，且仍形成24聚体壳状结构，因此仍可作为载体应用于纳米材料的合成;其显著优点在于可通过加入小分子化合物氯化血红素使铁蛋白温度稳定性提高，可应用于温敏性材料的合成。
【附图说明】
[0022]图1是PET32Ek/LIC_M52A的琼脂糖凝胶核酸电泳图；
[0023]图2是M52A的SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0024]图3是M52A和M52A+Hemin在25°C下圆二色谱扫描图；
[0025]图4是M52A和M52A+Hemin在200-600nm范围内的紫外可见扫描图；
[0026]图5是野生型铁蛋白、突变体M52A以及M52A+Hemin的热稳定性比较图。
【具体实施方式】
[0027]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0028]实施例1
[0029]大肠杆菌铁蛋白突变基因M52A的制备方法:
[0030]以含有野生型大肠杆菌铁蛋白基因的质粒pET32Ek/LIC为模板，通过常规PCR的方法可得到含有点突变M52A的基因序列(引物采用实施例2的引物)。
[0031]大肠杆菌铁蛋白突变体M52A基因序列如SEQ NO:1所示。
[0032]实施例2
[0033]大肠杆菌铁蛋白基因M52A的克隆:
[0034]用下述一对引物PCR扩增实施例1中的大肠杆菌铁蛋白基因:
[0035]上游引物:5，-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3，
[0036]下游引物:5，-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’
[0037]PCR反应体系:IyL合成序列(实施例1所得)，IyL上游引物，IyL下游引物，10yL5 XPrimeSTARTMBuffer,32.5yL ddH20,4yL dNTP,0.5yL PrimeSTARTMHS DNA聚合酶。
[0038]PCR 反应条件:95°C5min ； 95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 4.5min，30 个循环;72°(3延伸10111；[11 ； 4°C 保温。
[0039]实施例3
[0040]重组克隆、表达载体pET32 Ek/LIC-M52A(实施例2所得)的验证:
[0041]将PCR产物(实施例2制备)进行琼脂糖凝胶验证:制备10%琼脂糖凝胶，加入核酸染料至终浓度为0.5yg/mL，将5yL DNA样品与IyL 6 XLoading Buffer混匀，小心加入加样孔中，同时加入 DL 10000或 I kb ladder Marker0
[0042]设定100?120V恒压电泳，待溴酚蓝前沿跑至距凝胶正极端约Icm左右时停止电泳。如图1所示，在7000bp处有明显的条带，与目的片段理论大小一致，说明此基因已被成功克隆。
[0043]实施例4
[0044]PET32 Ek/LIC-M52A(实施例2所得)重组质粒的去模板、纯化、磷酸化及自身环化:
[0045]构建反向PCR产物去模板反应体系(50yL):44yL反向PCR产物(实施例2所得)，5yLDpnI Buffer1IyL DpnI，置于37°C水浴4h。
[0046]为降低产物浓度，采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(B10MIGA，上海)。
[0047]DNA浓缩后进行磷酸化反应:8yL PCR纯化产物；IyL T4 LigaselOXbuffer; IyLT4Polynuc