一种与植物抗逆性相关的GmSIZ1a/b蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关的GmSIZla/b蛋白及 其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 大豆是世界上最重要的商业作物之一，然而它却严重的感染各种病原体。大豆疫 霉菌（Phytophthora sojae)属卵菌纲类导致大豆根腐病的植物病原体，成为最具破坏性的 大豆病害之一，每年导致10-20亿美元的损失。大豆植株至少通过两种不同的机制抵御大 豆疫霉菌：单基因 （Rps gene)介导的效应引发的免疫反应（ETI)和多基因调控的部分抗性 (partial resistance),这可能与本底防御（basal defense)和弱的ETI相关联。目前，约 有二十个Rps基因已被定位到四个染色体上。这些Rps基因中只有Rpslk，RpsYD29，RpslO 和RpsJS被精细定位。然而Rps基因调控大豆抵御大豆疫霉菌的分子机制仍不清楚。由于 Rps基因介导的抗大豆疫霉菌具有特异性，单一 Rps基因介导的抗性只能维持大约8-15年。 因此，迫切需要选育出能够维持长久抗性的大豆品种。提高大豆对疫霉菌部分抗性是一个 有效途径，因为部分抗性能维持长久和广谱抗性。
[0003] SUMO (small ubiquitin-related modifier)化是一种蛋白质翻译后修饰，通过 El (SUM0激活酶）、E2 (SUM0结合酶）、E3 (SUM0连接酶）把SUMO连接到底物的赖氨酸SUMO 化位点。目前研究发现SUMO化修饰与植物和病原菌的互作密切相关，但尚不清楚其是否调 控植物抗疫霉病反应。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种GmSIZla蛋白质。
[0005] 上述所述的蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种GmSIZlb蛋白质。
[0009] 上述所述蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：
[0010] a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
[0012] 与上述所述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
[0013] 上述所述的生物材料为下述BI)至B3)中的任一种：
[0014] BI)编码上述所述蛋白的核酸分子；
[0015] B2)含有BI)所述核酸分子的重组载体；
[0016] B3)含有BI)所述核酸分子的重组菌、含有B2)所述重组载体的重组菌。
[0017] 上述生物材料中，BI)所述的编码GmSIZla蛋白的核酸分子如序列表中序列1的 第1-2643位核苷酸分子所示；
[0018] BI)所述的编码GmSIZlb蛋白的核酸分子如序列表中序列3的第1-2640位核苷酸 分子所不。
[0019] 本发明还有一个目的是提供上述所述蛋白质、或所述相关生物材料在提高植物抗 逆性中的应用。
[0020] 上述应用中，所述抗逆性为对大豆疫霉菌的抗性。
[0021] 本发明最后一个目的是提供一种提高植物抗逆性的方法。
[0022] 上述所述的提高植物抗逆性的方法，包括如下步骤：抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb 蛋白的编码基因在出发植物中表达，进而使植物的抗逆性提高。
[0023] 上述方法中，所述抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb蛋白的编码基因在出发植物中表 达的方法为：向出发植物中导入抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb蛋白的编码基因表达的干扰 片段。
[0024] 上述方法中，所述干扰片段的序列如序列1第1894-2249位核苷酸分子所示。
[0025] 上述方法中，所述干扰片段是通过干扰载体导入的。
[0026] 上述方法中，所述干扰载体的构建方法，包括如下步骤：用限制性内切酶SacI和 PmeI将pFGClOOS酶切，取小片段，记作中间片段；将所述中间片段连接到用限制性内切酶 SacI和PmeI酶切后的pCambia3300载体中，获得pCambia3300_RNAi载体；再将序列1第 1894-2249位核苷酸分子所示的干扰片段通过限制性内切酶Ascl/Swal和BamHI/Spel，正 向和反向连入pCambia3300-RNAi载体中，最终获得pCambia3300-GmSIZlRNAi重组载体，即 为干扰载体。
[0027] 上述方法中，所述抗逆性为对大豆疫霉菌的抗性。
[0028] 上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为 大豆。
[0029] 序列1中第1894-2249位核苷酸分子所示的干扰片段也属于本发明的保护范围。
[0030] 本发明还有一个目的是提供一种干扰载体。
[0031] 上述所述的干扰载体的构建方法：用限制性内切酶SacI和PmeI将pFGC1008酶 切，取小片段，记作中间片段；将所述中间片段连接到用限制性内切酶SacI和PmeI酶切 后的pCambia3300载体中，获得pCambia3300-RNAi载体；再将序列1第1894-2249位核 苷酸分子所示的干扰片段通过限制性内切酶Ascl/Swal和BamHI/Spel，正向和反向连入 pCambia3300-RNAi载体中，最终获得pCambia3300-GmSIZlRNAi重组载体，即为干扰载体。
[0032] 本发明提供了一种与植物抗逆性相关的蛋白GmSIZla/b及其编码基因与应用。结 果表明：蛋白GmSIZla/b可以调节大?与大?疫霉囷相互作用，并提供一种策略来提1?大 豆抗大豆疫霉菌的抗性。
【附图说明】
[0033] 图1为大豆GmSIZla/b和拟南芥AtSIZl蛋白的结构域示意图。
[0034] 图2为GmSIZla和GmSIZlb互补拟南芥siz 1-2突变体的矮化表型图。
[0035] 图3为GmSIZla/b互补sizl-2中热胁迫诱导的SUMO化修饰水平得到恢复。
[0036] 图4为GmSIZlRNAi转基因植株和野生型植株的抗性检测和GmSIZla/b表达量检 测的对比图。
[0037] 图5为GmSIZlRNAi转基因植株中热胁迫诱导的SUMO化修饰水平降低表型。
[0038] 图6为GmSIZlRNAi转基因植株的抗Phytophthora sojae的表型。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 本研究所用的植物材料为大豆（Glycine max L. Merr. Cv)，品种为中豆32,在文献 "郭兵福，蒋凌雪，李脉泉，顾海蓝，金龙国，邱丽娟。不同大豆品种对触杀型除草剂的耐受 性，中国油料作物学报，2012, 34 (5) : 551-555"中公开过，公众可从中国农业科学院作物科 学研究所获得。大豆种子在去离子水的滤纸上萌发1天后，然后转移到土壤中，在100 μ mol m 2 s 1的光下（16小时光照/8小时黑暗）、温度为25°C和相对湿度为70%的条件下生长。
[0042] 拟南芥 sizl-2 突变体和 AtSIZl 启动子在文献"Jin JB，Jin YH，Lee J，Miura K，Yoo CY，Kim WY，Van Oosten M，Hyun Y，Somers DE，Lee I，Yun DJ，Bressan RA, Hasegawa PM. The SUMO E31igase，AtSIZl，regulates flowering by controlling a salicylic acid-mediated floral promotion pathway and through affects on FLC chromatin structure. 2008, Plant J 53:530-540"中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
[0043] PsJS2 菌种为大 ? 疫霉菌（Phytophthora so jae)在文献中 "Zhang J, Sun S, Wang G,Duan C, Wang X, Wu X,Zhu Z.Characterization of Phytophthora resistance in soybean cultivars/lines bred in Henan province. Euphytica, 2014, 196:375-384"中公 开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0044] 实施例1、GmSIZla/b基因的获得
[0045] 1、引物：Fl (正向引物）：5' -CGGGATCCATGGATTTGGTACCGAGCG-3' ;R1 (反向引物）： 5' _CGGGATCCTCTCTGAATCTGAATCAATAGAA_3'。
[0046] 2、提取大豆叶片的RNA，并反转录获得cDNA。
[0047] 3、以上述cDNA为模板，采用步骤1设计的引物对，PCR扩增GmSIZla/b基因。
[0048] 4、对扩增产物进行测序，测序结果表明：GmSIZla蛋白如序列表的序列2所示，其 编码基因序列如序列表的序列1所不；GmSIZlb蛋白如序列表的序列4所不，其编码基因序 列如序列表的序列3所示。
[0049] 实施例2、转基因植株的获得
[0050] 1、载体的构建
[0051] 用限制性内切酶HindIII和NcoI酶分别将实施例1中获得的GmSIZla/b全长cDNA 和pCambial302载体进行双酶切，连接，获得重组载体。再将AtSIZl启动子区域分别连入 重组载体，获得 pCambial302-ProAtSIZl:GmSIZla:GFP 载体和 pCambial302-ProAtSIZl:Gm SIZlb = GFP载体，并对其进行测序验证。
[0052