一种肿瘤抑制蛋白变体dv398及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。
【背景技术】
[0002] 肿瘤相关蛋白DENND2D-V2,由468个氨基酸残基组成，自序列4的氨基末端第47至 145位氨基酸残基为uDENN结构域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸残基为DENN结 构域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸残基为dDENN结构域。该肿瘤相关蛋白在小 鼠成纤维细胞内稳定高表达可以明显抑制该细胞的恶性转化;在mRNA水平检测其在细胞系 中的表达结果表明，肺癌细胞系中的表达水平显著低于原代培养的正常支气管上皮细胞； 在肺癌临床组织标本中检测其表达水平结果表明，肺癌组织的表达水平明显低于其周边的 正常组织。该肿瘤相关蛋白可用于肿瘤的体外诊断、预后。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因 的重组真核表达载体在导入肺癌细胞系中后，能单独引起肺癌细胞系的生长变缓及致瘤性 减弱。因此，该蛋白具有较好的肿瘤药物应用前景。
[0003] 在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和 取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人 通过大量的实验，针对DENND2D-V2氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比 DENND2D-V2蛋白本身具有更高抑制活性的变体。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO: 1的成熟多 肽的位置 53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、 297(：、3056、322￥、3471^、379?、3980、4330或4511^的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体 具有改善的抑制活性。
[0005] 优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体包含至少1种任一 下述修饰：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、 225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、 433Q/S、451L/V。
[0006] 本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞;和(b)回收 所述蛋白变体。
[0007] 在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培 养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下 进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料 分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所 述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据 公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）。如果多肽分泌到营养培养 基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物 (lysate)回收。
[0008] 所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养 培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0009] 本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析 (例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）、电泳方法（例如，制备型 (preparative)等电聚焦）、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或提取(参见，例如， Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)〇
[0010] 本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1:DENND2D-v2基因的获得
[0012] DENND2D-V2：
[0013] 上游引物5 ' CACTCCAGGGGCCATGGATG3 '
[0014] 下游引物5 ' GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3 '
[0015] 用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库（Clontech: K1420-1)为模板进行PCR扩增 反应，反应条件如下：
[0016] 反应体积50μ1，其中含有： 人正常肺组织CDNA模板 5 P l(5ng)
[0017] 引物 正向引物、反向引物终浓度各0:.2μ M dMP 终浓度各200 μ M Taq DNA 聚合酶 2.5U
[0018] 10 X Taq DNA聚合酶缓冲液 5 μ 1
[0019] 用双蒸水补足至50μ1体积。
[0020] 反应温度、时间：94°C，变性5分钟；然后94°C变性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸1 分钟，扩增30个循环;最后在72°C下延伸10分钟。
[0021 ]扩增产物为3'带有碱基A的3'突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen， 28706)按产品说明书进行纯化，然后与3'有碱基T的线性pGEM-T EASY载体（Promega， A1360)在16°C下连接8小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5a，转化物在含氨苄青 霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700 DNA分析仪 (Perkin-Elmer/AppI ied Biosystem)测序，获得DENND2D_v2基因的全长cDNA，长度为 1905bp，其编码序列是自序列的5'端第57至1463位脱氧核糖核苷酸，编码468个氨基酸。
[0022] 实施例2:相应突变后的DENND2D-V2基因的获得方法
[0023] 1.突变点的引入
[0024] (1)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在DENND2D-V2 基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
[0025] (2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的 质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞；
[0026] 2.鉴定重组质粒：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到突 变后的核苷酸序列。
[0027] 实施例3、DENND2D_v2变体对肺癌细胞系H1299生长抑制作用
[0028]将实施例2获得的突变后的核苷酸序列回收后直接正向连入pcDNA3.1/V5-His TOPO TA( Invitrogen，K4800)真核表达载体，经双向测序和酶切鉴定无误，得到正向插入突 变后的核苷酸序列的cDNA基因质粒，命名为pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-DENND2D-V2,简称 pcDB3.1-DENND2D-v2〇
[0029] 1、细胞凋亡的观察与检测：
[0030] (1)阳性对照质粒pcDB3 · I-BAX质粒的构建
[00311 pcDB3.1-BAX为凋亡实验的阳性对照，按照下述方法构建：以人正常肺组织cDNA文 库（Clontech: K1420-1)为模板，利用Taq酶进行PCR反应扩增BAX的全长cDNA基因 （Genbank No.NM_138761)。琼脂糖电泳回收PCR产物，连接到pGEM-T-easy载体中进行测序，将测序正 确的片段用限制性内切酶EcoRI (Promega)从pGEM-T-Bax载体上切下，同时用EcoRI酶切真 核表达载体pcDNA3 · l/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)，将酶切后的Bax的cDNA基因片段 与载体在16°C下连接8小时，转化大肠杆菌DH5a，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上 生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoR頂每切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有 插入片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪），选出正确的正向插入 Bax的cDNA基因质粒，命名为口0083.1-84乂40083.1-84乂不带有(：-11^和11丨8标签。
[0032] (2)瞬时转染H1299细胞:将H1299细胞以IX 105传入六孔板中，24小时待细胞贴壁 生长后，按照1^口<^6(^3111；[116 2000说明书提供的操作方法，将。00麻3.1/1115^把8(-)13， pcDB3.1-DENND2D-V2变体，pcDB3.1-BAX质粒分别转染入各孔细胞，所用质粒DNA及转染试 剂的量为推荐量的1/2以降低细胞毒性。转染后4小时更换培养基，待转染后36小时收取细 胞。按照Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(CALBI0CHEM，PF032)说明进行 Annexin V FITC和PI双染，流式细胞仪检测。结果如下表所示。
[0033] 2、细胞周期的观察与检测：
[0034] ΡΓ流式细胞法进行细胞周期检测：将空载体H1299-VeCtor细胞，稳定高表达 DENND2D-V2变体的H1299-DENND2D-V2变体单克隆细胞以2 X 105个传入60mm细胞培养皿中， 37°C5 % C02培养至融合率达到80 %左右。消化收取细胞，80 %乙醇（用I3BS配制）-20°C固定 过夜(大于8小时）。经PI染色后，上机检测。如下表所示，DENND2D-V2变体的外源性高表达能 将H1299显著阻滞在G1/S期。
[0035] 3、软琼脂集落形成实验:采用空载体Hl 299-vector细胞，Hl 299-DENND2D-V2野生 型细胞，筛选得到的稳定表达DENND2D-V2变体的H1299-DENND2D-V2变体单克隆细胞株进行 实验。实验用六孔板进行，每孔先加入1.5毫升含10%胎牛血清、0.5%琼脂的DMEM培养基， 室温冷却后，将建成的稳定转染细胞系，各5000个细胞加到含10%胎牛血清、0.35%琼脂糖 的DMEM培养基中，混合后加到上述底层培养基上，培养2-3周，每皿加入0.511110.2%?-iodonitrontetrazilium 〇11；[101^(16染色1小时以上;镜下观察照相，计数大于200微米的克 隆。每组重复三个孔。裸眼及光镜下观察，三组平行实验集落形成结果数目比较如下表所 不。
[0039]以上实施例说明，DENND2D-V2基因变体可诱导凋亡，在细胞周期G1/S期具有明确 的细胞周期阻滞能力，这是其抑制细胞生长增殖能力的主要原因。同时转入DENND2D-V2变 体后的细胞在软琼脂中独立生长的能力较未突变蛋白明显减弱。
【主权项】
1. 一种肿瘤抑制蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示。2. -种人肿瘤抑制蛋白变体，其特征在于，在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸的基础上，在 398Q/R进行相应的取代。3. 如权利要求2所述的蛋白变体在制备抑制肺癌药物中的用途。4. 一种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2所述的蛋白变体以及药学上合适的载体。
【专利摘要】本发明提供了一种肿瘤抑制蛋白的变体，该变体是在SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸的基础上，分别在53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S或451L/V进行相应的取代。该蛋白变体相对于野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的效果。这些变体蛋白质和它们的衍生物可以用于多种肿瘤的治疗。
【IPC分类】A61P35/00, C07K14/47, A61K38/17
【公开号】CN105504040
【申请号】CN201610003729
【发明人】马恒标
【申请人】马恒标
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年5月15日
【公告号】CN103992399A, CN103992399B, CN105384806A, CN105418743A, CN105418744A, CN105418745A, CN105418746A, CN105418747A, CN105418748A, CN105418749A, CN105440121A, CN105440122A, CN105461795A, CN105461796A, CN105461797A, CN105461798A, CN105481968A, CN105481969A, CN105481970A, CN105481971A, CN105504041A, CN105541993A, CN105566488A