一种人纤维蛋白原的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种纤维蛋白原的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人纤维蛋白原主要富含在冷沉淀和组分I中，目前国内具备人纤维蛋白原生产的 厂家主要有华兰生物、江西博雅等少数几家，绝大部分生产企业均采用从组分I中经两次乙 醇沉淀法提取，生产工艺步骤繁杂，最终产品纯度和生物活性均不是非常理想。
[0003] 人纤维蛋白原为凝血因子，在临床应用上主要是治疗获得性纤维蛋白原减少症： 严重肝脏损伤;肝硬化；弥散性血管内凝血;产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起 的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。人纤维蛋白原为人源性血液制剂，临床副作用少，其 制备生产中专门的病毒灭活工艺，安全性具有可靠的保障，作为治疗出血性外科用必备制 剂，目前国内属紧缺药物。
[0004] 面对国内人纤维蛋白原制剂的短缺，现阶段如何提高血浆的综合利用率，研发出 高纯度、高活性、安全性高，工艺简洁易操作、成本低廉的人纤维蛋白原制剂具有积极意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种如何提高血浆的综合利用率，研发出高纯 度、高活性、安全性高，工艺简洁易操作、成本低廉的人纤维蛋白原的制备方法。
[0006] -种人纤维蛋白原的制备方法，以冷沉淀为起始原料，包括如下步骤：
[0007] (1)将冷沉淀溶解；
[0008] (2)澄清过滤；
[0009] (3)S/D 灭活；
[0010] (4)Q Sepharose fastflow凝胶吸附层析处理；
[0011] (5)离心收集沉淀，除菌分装，冻干、乳盖、干热灭活后得到产品。
[0012] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤（1)具体包括如下步骤:将新 鲜制备的冷沉淀切成1-3厘米块状，用3倍体积的浓度为0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液 在24~26°C条件下溶解，加入肝素钠溶液至最终浓度为0.005-0.065 %，加入氢氧化铝凝胶 悬液至最终浓度为5%，搅拌30分钟后离心收集上清液。
[0013] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(2)具体包括如下步骤:用经 预处理的Iym孔径的滤芯进行澄清过滤，用平衡液冲洗滤芯至冷沉淀4倍体积。
[0014] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(3)具体包括如下步骤:准确 计量过滤液体积，按1:10的体积比在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使蛋白液中聚山梨 酯80最终浓度为1 %，磷酸三丁脂最终浓度为0.3%，升温至24~26°C，保温6小时后经0.6μπι 孔径的滤芯进行澄清过滤。
[0015] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤（4)具体包括如下步骤：Q Sepharose fastf low凝胶吸附层析处理:将澄清过滤后的溶液上样，结束后用3倍体积的平 衡液冲洗，用3倍体积的洗涤液冲洗，用3倍体积的洗脱液洗脱并收集洗脱液至经处理过的 无菌、无热原的指定容器中，冲洗环境温度保持20-25°C。
[0016] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(5)具体包括如下步骤:准确 计量洗脱液体积，加入甘氨酸至最终浓度为15%，搅拌30分钟后离心，收集沉淀，用3-4倍体 积的溶解液溶解，根据蛋白含量的检验结果用透析液调节调整蛋白浓度至3.5±0.5%;配 制后的半成品经除菌分装，冻干、乳盖，100°C、30分钟干热灭活后得到产品。
[0017] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(2)和步骤(4)中的平衡液为 枸橼酸钠〇. 〇 Imo I/L，甘氨酸0.12mo I/L，氯化钠0.12mo I/L，pH值为6.9-7.1。
[0018] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，所述洗涤液为:枸橼酸钠0.Olmol/ L，甘氨酸0.12mo 1/L，氯化钠0.16mo 1/L，pH值为6.9-7.1;洗脱液为:枸橼酸钠0.0 Imo 1/L，甘 氨酸0 · 12mol/L，氯化钠0 · 25mol/L，pH值为6 · 9-7 · 1。
[0019] 本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法制备得到的人纤维蛋白原。
[0020] 本发明所述的人纤维蛋白原，其中，所述人纤维蛋白原仅与抗人血浆产生沉淀线， 与抗马、牛、猪、羊血浆不产生沉淀线。
[0021] 本发明人纤维蛋白原的制备方法与现有技术不同之处在于：
[0022] 本发明人纤维蛋白原的制备方法具有如下有益效果：
[0023] 1、采用冷沉淀为原料，该工艺不仅能制备人纤维蛋白原，而且提取完人纤维蛋白 原后能更好的提取人凝血因子VIII，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，提高经济 效益。
[0024] 2、采用色谱凝胶结合甘氨酸提取纯化生产工艺，不仅减少生产步骤，工艺过程质 量更易监控，降低了对大型设备的要求，成本低廉，且生物活性及纯度高，极大的提高经济 效益。
[0025] 下面结合具体实施例对本发明的人纤维蛋白原的制备方法作进一步说明。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] 采用低温离心分离法从人血浆中制备冷沉淀。
[0028] a、血浆融化
[0029] 血浆融化应在十万级洁净间内进行。水浴融化法。水浴融化法的水温应控制在37 °C以下。
[0030] b、血浆合并
[0031] 血浆合并应在十万级通风口下进行，合并之前，应对血浆袋进行消毒处理，即用 75 %酒精浸泡三分钟以上，用干净纱布将血浆袋外部酒精擦净后才能合并。合并血浆时，应 注意点滴回收。
[0032] c、冷沉淀离心分离
[0033] 将混合血浆温度降至0°C以下，以3 ± IL/台/分进行离心分离，出液温度控制在0-4 0C。
[0034]附冷沉淀原料质量标准
[0035] 1.冷沉淀原料为采用低温离心分离法的血浆组分。所用血浆原料应符合"血液制 品生产用人血衆"规定
[0036] 2.冷沉淀应尽能保持无菌和低温冰冻保存，保存温度不得超过_30°C，保存期应不 超过1年。
[0037] 3.冷沉淀的检定
[0038] 准确称取冷沉淀10g，用生理氯化钠溶液稀释至100ml，在1~3°C搅拌充分溶解后 离心或过滤，取上清液进行以下项目检测。
[0039] 3.1人纤维蛋白原凝固活力检测
[0040] 于反应管内加入已预热至37°C的凝血酶溶液(3IU/ml)0.5ml，再加入用生理氯化 钠溶液稀释成3mg/ml的供试品溶液0.5ml，摇匀。置37°C记录凝固时间。两次测定结果平均 值应不超过60秒。
[0041 ] 3.2细