抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
【专利说明】抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法 氏囊病制剂中的应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及抗鸡传染性法氏囊病毒的SCFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病 制剂中的应用。
【背景技术】
[0003] 鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病 毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，IBDV 主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，损伤鸡的中枢免疫器官一一法氏囊。具有传播速度快、 传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前在全球范围内均有分布，是养禽业最重要 疾病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。
[0004] IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，导致免疫抑 制，从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。抗体药物目前 是有效的治疗药物，高免血清和卵黄抗体在发病早期均可起到良好的效果，但是由于工业 化生产可控性差和存在水平传播疾病等原因而受到限制。本发明利用抗原-抗体共表达的 细菌展示技术筛选获得了具有较高中和活性抗IBDV的scFv抗体。抗体药物抗病毒的中和活 性与治疗效果成正比，中和活性越高，其治疗效果越好。本发明提供的scFv抗体的中和活性 显著提高，将具有更好的治疗效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体在治疗或预防鸡传染性 法氏囊病制剂中的应用。该scFv抗体的中和活性比已授专利权的scFv-LTH抗体(专利"scFv 抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用"中的scFv抗体 在此专利中命名为scFv-LTH抗体）高60倍以上，在预防及治疗IBD将具有更好的效果。该 scFv抗体与scFv-LTH抗体的核苷酸的同源性为88.66%，氨基酸的同源性为79.67%，说明两 株scFv是完全不同的两种抗体。
[0006] 本发明提供了 一种单链抗体，命名为scFv-GXC抗体，包括由重链可变区、轻链可变 区以及它们之间的连接区组成； 所述重链可变区为如下(a)或(b): (a)由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸残基 组成的蛋白质；（b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相 同活性的由其衍生的蛋白质； 所述轻链可变区为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸残 基组成的蛋白质；（d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0007] 所述单链抗体具体可为如下(e)或(f):(e)由序列表中序列1所示的蛋白质；（f)将 (e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的 蛋白质。
[0008] 编码所述单链抗体的基因也属于本发明的保护范围。
[0009] 所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1)或(2)或（3):(1)序列表的 序列2自5'末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子;（2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂 交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源 性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010] 所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6): (4)序列表的 序列2自5'末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子；（5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列 杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同 源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011] 所述基因具体可为如下(7)或(8)或(9)或（10): (7)序列表的序列2自5'末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在严格条件下与（7)或 (8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)与（7)或(8)限定的DNA 序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0012] 上述严格条件可为在6 XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2X SSC、 0.1%505和1\55(：、0.1%505各洗膜一次。
[0013] 含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。
[0014] 基于所述单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的 抗体可为Fab形式的抗体、I gG形式的抗体等。
[0015] 本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用;所述产 品的功能为如下（I)、（ Π )或（ΙΠ )或(IV) : (I)检测鸡传染性法氏囊病病毒;（Π )辅助鉴定鸡 传染性法氏囊病病毒；（ΙΠ )预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或治疗由鸡传 染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
[0016] 含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述 产品的功能为如下（I)、（ Π )或（ΙΠ )或(IV) : (I)检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Π )辅助鉴定 鸡传染性法氏囊病病毒；（HO预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或治疗由鸡 传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
[0017] 本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊 病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
[0018] 本发明提供了 一种单链抗体（即ScFv-GXC抗体），SCFv-GXC抗体具有与VP2蛋白及 多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生CPE且其中和活性比 已授专利权的scFv-LTH抗体高60倍以上。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁 琐、生产成本高、效果不稳定、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发 明提供的scFv-GXC抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果更好，工业化生产质量 可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点。
【附图说明】
[0019 ] 图1为s CF V-GXC抗体溶液的SDS-PAGE图谱。
[0020] 图2为ScFv-GXC抗体溶液的SEC-HPLC图谱。
[00211图3为ELISA检测scFv-GXC抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。
[0022]图4为ELISA检测scFv-GXC抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0024] pET_27b( + )载体：购自Novagen公司，Cat. No. 69337-3。大肠杆菌Rosetta:购自 Novagen公司，Cat. No. 71403-4 AFl细胞(鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命科学 研究院细胞资源中心，Cat. N〇.3131C000100040003(LSPF雏鸡:购自哈尔滨兽医研究所。鸡 新城疫灭活疫苗(La Sota株），购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
[0025]鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gt株）：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染 性法氏囊病中等毒力活疫苗(NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染 性法氏囊病活疫苗（1-65株）：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病 活疫苗(BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗 (MB株）:ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株）：湖南省中岸生物药业有 限公司，编号180022026。
[0026]质粒pHisSUMO:参考文献：姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德山. 利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报，2008, 39(10): 57-62;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体--pHisSUMO.生物 技术，2009，19(3): 11-14·。
[0027]包被液(pH9.6):取Na2CO3 0.15g、NaHC03 0.293g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0028] PBS缓冲液：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP〇4.12H2〇 3.58g、KH2P〇4 0.24g，溶于IL 水。
[0029] 实施例1、scFv-GXC抗体(单链抗体)及其编码基因的发现 1、抗体库的构建 取MDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出 克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片 段分别插入到pTl inker载体的Linker的上游和下游，构建出ScFv抗体库。将ScFv抗体库进 行酶切并与细菌展示载体pBH)-Ab-VP2进行连接，构建抗IBDV抗原抗体共表达的细菌表面 展示文库。VH 约 380bp、VL 约