蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术和基因工程技术领域，涉及一种通过蛋白荧光定位快速检测 蛋白质相互作用的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白相互作用网络是生物信息调控的主要表现形式，是决定细胞生命活动的关键 因素。阐释蛋白质之间的相互作用关系，是理解细胞的生物学活性、蛋白的信号转导机制及 生物代谢等等生命过程至关重要的一环，能为确定蛋白质在整个生命过程中所办扮演的作 用提供决定性的线索。
[0003] 目前蛋白相互作用的研究方法最常用的方法有免疫共沉淀（C 〇 _ immunoprecipitation，Co-IP)、酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybrid System)、焚光共振能 量转移（Fluorescent Resonant Energy Transfer ,FRET)、双分子焚光互补（Bimolecular Fluorescent Complement，BIFC)等。但是，不同的方法都存在不同的优缺点，比如免疫共沉 淀法操作复杂、不能保证沉淀的复合物为直接相互作用蛋白；酵母双杂交方法只能验证细 胞核内的相互作用，并且容易出现假阳性;双分子荧光互补和荧光共振能量转移方法操作 相对较为简单、方便，但是存在假阳性较多的问题。因此仍旧需要对研究蛋白相互作用的方 法加以改进。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白 相互作用的方法，该方法能够在细胞水平上快速检测蛋白的相互作用。
[0005] 本发明采取的技术方案如下：
[0006] 1、用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，所述蛋白荧光定位检测系 统由四种融合蛋白组成：（1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；（2)荧光蛋白A、核定 位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；（3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；（4)荧光 蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；
[0007] 所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检 测是否存在相互作用的两个蛋白。
[0008] 优选的，所述荧光蛋白、核定位信号和待测蛋白顺次连接。
[0009] 优选的，所述荧光蛋白A、B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。
[0010]优选的，所述红色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述绿色荧光蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述核定位信号序列如SEQ ID No.3所示。
[0011] 2、上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因。
[0012] 3、含有上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因的重组表达载 体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
[0013] 优选的，所述重组表达载体为Piz-V5/His载体，所述重组菌为大肠杆菌DH5a，所述 转基因细胞系为家蚕卵巢细胞系BmN-SWUl。
[0014] 4、上述蛋白荧光定位检测系统在检测蛋白相互作用中的应用。
[0015] 5、上述编码基因在检测蛋白相互作用中的应用。
[0016] 6、上述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒在检测蛋白相互作用中的 应用。
[0017] 本发明的有益效果在于:本发明蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图如图13所 示，本发明通过利用具有核定位信号和没有核定位信号的绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白构 建四个荧光蛋白融合表达载体，若被研究的蛋白之间存在相互作用，则具有荧光标记的融 合蛋白就会被另外一个蛋白拉入细胞核内或被拉出细胞核;若被研究的蛋白之间没有相互 作用，则被研究的荧光标记的融合蛋白定位不会发生变化。该方法可以在细胞中检测两个 都具有核定位信号的蛋白之间的相互作用、一个具有核定位信号的蛋白和一个没有核定位 信号蛋白之间的相互作用以及两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用。另外，该方 法消除了先前荧光双分子互补技术和荧光共振能量转移的假阳性问题。
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图 1 为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和pIZ-DsRed 构建示意图；
[0020] 图 2 为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和pIZ-DsRed 表达载体转染到BmN-SWUl细胞中后焚光蛋白的不意图；标尺为5ym;
[0021 ] 图3为pIZ-LEFl I-DsRed和核定位信号突变的Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed单独转染 细胞后的焚光蛋白定位不意图；标尺为5ym;
[0022] 图 4 为pIZ-LEFl I(KlOOL)-DsRed和 pIZ-EGFP、pIZ-LEFl I-EGFP分别共转染后的荧 光蛋白定位不意图；标尺为5ym;
[0023] 图5为免疫共沉淀验证对Piz-LEFl I(KlOOL)-DsRed和pIZ-LEFll-EGFP相互作用的 进一步验证结果；
[0024] 图6为LEF-I IN端截短载体构建示意图；
[0025] 图7为LEF-IlN端截短载体的细胞定位示意图;标尺为5μπι;
[0026] 图8为LEF-IlN端截短载体和pIZ-LEFll-EGFP共同转染后，荧光蛋白定位分析示意 图；标尺为5μηι;
[0027] 图9为BIFC对LEF-I IN端截短载体和pIZ-LEFl I-EGFP相互作用的进一步验证示意 图；标尺为5μηι;
[0028] 图10为本发明所述蛋白荧光定位检测系统在研究两个不具有核定位信号的蛋白 细胞定位和加上核定位信号的示意图；标尺为1〇μπι;
[0029] 图11为蛋白荧光定位检测系统在一个蛋白加上核定位信号后共定位示意图；标尺 为IOym;
[0030] 图12为蛋白荧光定位检测系统鉴定两个不具有核定位信号蛋白的相互作用进一 步免疫共沉淀的验证结果；
[0031] 图13为蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图。
【具体实施方式】
[0032] 本发明以研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中的复制关键因子LEF-Il的自身相互 作用作为实施例2,鉴定两个同时具有核定位信号蛋白之间相互作用的检测方法；以 BmNPVLEF-11自身核定位和多聚化特征为实施例3，鉴定一个具有核定位信号和一个不具有 核定位信号的蛋白之间相互作用的检测方法；以家蚕细胞中Gem2基因的相互作用蛋白为实 施例4,鉴定两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用检测的方法。
[0033] 下面将结合附图，对本发明3个具有不同核定位方式的蛋白之间的相互作用实例 进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0034]需要说明的是，本发明所述内容中以NSL表示核定位信号，DsRed表示红色荧光蛋 白，EGFP表示绿色荧光蛋白。
[0035]实施例1、蛋白荧光定位检测载体构建
[0036]登陆NCBI数据库，下载目前已知的表达DsRed和EGFP蛋白的核苷酸序列，其序列分 别如SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示，根据口12-￥5/把8(11^丨廿(^611公司）载体的多克隆位 点设计具有核定位信号序列和不具有核定位信号序列的相应引物，然后送华大基因合成， 引物序列如下：
[0043] 核定位信号序列如SEQ ID No.3所示。
[0044] 如图1示意图所示，将合成的引物根据相应的模板扩增并通过Hind III和Kpn I酶 切连接到经过相应酶切的pIZ_V5/His载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，然 后用含有博来霉素 (Zeocin)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，酶切验证正确 后使用。
[0045] 将构建好的 pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和 pIZ-DsRed 表达载体转染 到BmN-SWUl细胞中，转染后48小时，用I XI3BST轻洗细胞3次，每次5min，然后加入质量分数 为4 %的多聚甲醛溶液，室温固定15min，用I XI3BST轻洗细胞3次，每次5min;加入细胞核染 料DAPI，37°C避光处理20min，用1 \?831'轻洗细胞3次，每次5111丨11。最后取出盖玻片在 Olympus激光共聚焦扫描显微镜下观察拍照，结果如图2所示。结果显示具有核定位信号的 EGFP和DsRed蛋白能够定位到细胞核内，不具有核定位信号的EGFP和DsRed蛋白在细胞核和 细胞质都有分布，证明构建系统可以用于后续实验。
[0046]实施例2、蛋白荧光定位检测系统鉴定蛋白相互作用的验证
[0047]由实施例1构建的蛋白荧光定位载体，能够定位到相应的位置，为了验证这个系统 能够以荧光定位变化观测两个蛋白间是否存在相互作用，首先分析LEF-Il具有核定位信 号，选择PlZ-EGFP和pIZ-DsRed为目标载体，构建了LEF-11 (序列如SEQ ID No.4所示)全长 融合DsRed和EGFP的载体pIZ-DsRed-LEFl 1/pIZ-EGFP-LEFl 1，同时构建了突变LEF-11 第 100 位的核定位信号关键氨基酸突变体序列如SEQ ID No.5所示;融合DsRed的载体pIZ-LEFll (KlOOL)-DsRed，对照载体为pIZ-EGFP。载体构建方法同实施例1，所有载体测序正确后使 用。
[0048]将以上载体 pIZ-DsRed-LEFl 1 和 Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed 分别转染到BmN-SWUl 细 胞中，转染后48小时，荧光观察这些荧光蛋白表达载体的定位，结果如图3所示，由图3可知， 荧光定位结果与推测结果一致，PlZ-DsRed-LEFll定位到细胞核内，而pIZ-LEFll(K100L)-DsRed由于缺失了核定位信号，定位到细胞质内，说明LEF-11确实具有核定位信号。
[0049] 将以上荧光蛋白融合表达载体Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed分别和载体pIZ-EGFP、 p IZ-EGFP-LEF11共同转染到细胞中，转染48小时后荧光观察结果如图4所示，由图4可知， Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed的定位确实因为和pIZ-EGFP-LEFll共同转染发生了变化，定位到 细胞核内，但和PIZ-EGFP共同转染的细胞定位并没有发生变化，这一结果说明本发明所述 系统确实可以通过观察蛋白的荧光定位检测蛋白之间的相互作用。
[0050] 为了更进一步确认系统的准确可靠，进一步通过免疫共沉淀进行验证，把pIZ-LEFlI(KlOOL)-DsRed和pIZ-EGFP-LEFll分别共转染到BmN-SWUl细胞中，转染48h后收集细 胞，加入ImL含PMSF的细胞IP裂解液重悬细胞，冰浴裂解30min;吸出IOOyL含有胞内蛋白的 裂解混合物作总蛋白组，剩余900此转到两个1.5mL离心管，每管450yL裂解混合物，并分别 加入2yLDsRed抗体(实验组)和2yL小兔IgG(对照组），4°C轻微摇晃孵育6-8h;分别在两个离 心管中加入60yL protein A+G蛋白磁珠，4°C孵育8h;4°C3000r/min离心5m