寄生于蒙古黄榆上粗毛纤孔菌的固体培养基和栽培料最佳配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤孔菌的固体培养基及栽培料的最佳配 方。
【背景技术】
[0002] 粗毛纤孔菌Inonotus hispidus(Bull · )P.Karst.俗名粗毛黄孔菌，是一种生长在 温带的木腐菌，桑黄中的一种，主要生长在活立木上，偶尔生长在倒木上。曾用名粗毛黄褐 孔菌Xanthochrous hispidus，隶属于担子菌门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，绣 革孔菌目Hymenochae tales，绣革孔菌科Hymenochaetaceae，纤孔菌Inonotus子实体于夏季 和秋季出现，晚秋后变黑，主要寄生在水曲柳Fraxinus mandschurica Rupr.、榆树Ulmus pumila L·、桑树 Morus alba L·、苹果树 Malus pumila Mill.和日本槐 Sophora japonica Linn.等阔叶树，东北地区主要寄生在水曲柳上，西北地区在桑树上常见;部分专家认为粗 毛纤孔菌属于桑黄中的一种，而桑黄最早记载于《本草纲目》中。中医认为桑黄性甘，平，味 苦，味辛，归肝，膀胱经。本品辛行甘和，入血分以化瘀，瘀血循经而行出血止，有化瘀之功 效，用于血崩，血淋，脱肛泻血，带下，闭经等疾病；由于人们对其无节制的采摘，导致粗毛纤 孔菌资源越来越匮乏且其野生子实体生长周期慢、腐蚀活木，寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤 孔菌在驯化栽培方面的研究未见报道，为此本专利首次对该粗毛纤孔菌进行研究，旨在找 出其固体培养基和栽培料的最佳工艺，为大量人工栽培粗毛纤孔菌奠定基础。
【发明内容】
[0003] 本发明公开了粗毛纤孔菌固体培养基和栽培料的最佳配方；
[0004] 1材料与方法
[0005] 1 · 1材料
[0006] 粗毛纤孔菌Inonotus hispidus菌株、葡萄糖、酵母浸粉等；
[0007] 1.2仪器
[0008] 高温高压灭菌锅;超净工作台；电子计数天平(MARK MW3型），常熟市金羊砝码仪器 有限公司;培养皿等；
[0009] 2实验内容与方法
[0010] 1.2方法
[0011] 1.2.1菌种活化:采用PDA加富培养基对粗毛纤孔菌菌种进行活化培养；
[0012]加富PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨lg，KH2P〇4〇.6g， MgS〇4 · 7H2〇 0.6g，蒸馏水 l，000mL，pH自然；
[0013] 1.2.2不同温度培养基筛选：以GPY培养基作为基础培养基，灭菌后将直径为0.8cm 的菌饼接入至供试培养基，将其分别移入到15°C、20°C、25°C、30°C、35°C和40°C的6个梯度 的生化培养箱中恒温培养，接种Id后开始每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝 长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰的看见菌丝边缘后停 止记录;GPY培养基:酵母浸粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，MgS〇4· 7H20 0.5g，KH2P〇4 lg，琼 脂25g，蒸馏水l，000mL;
[0014] 1.2.3不同初始pH培养基筛选试验：以GPY培养基作为基础培养基，供试培养基灭 菌前用0.2mol/L Na2HP〇4 · 2H20和0.1mol/L柠檬酸，用二者适量混合配置成8个pH梯度即： 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5共8个梯度，每个处理重复10次。灭菌后将直径为 0.8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培养箱内30°C条件下恒温培养，接种Id后开始 每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝 直径长至6cm左右且能清晰的看见菌丝边缘后停止记录；
[0015] GPY培养基制作方法同1.2.2
[0016] 1.2.4不同碳源培养基筛选试验:在无碳培养基的基础培养基上分别加入20g果糖 (7.99 8/1)、木糖(7.998/1)、可溶性淀粉(7.998/1)、葡萄糖(7.26 8/1)、麦芽糖(7.998/1)、 蔗糖(8.41g/L)和乳糖(7.99g/L)作为碳源筛选试验的7种不同水平，每个处理重复10次并 以无碳培养基作为对照，灭菌后将直径为〇. 8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培养 箱内30°C条件下恒温培养，接种Id后开始每天固定时间用划线法测量菌落直径、观察菌丝 长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后停 止记录；
[0017]无碳培养基：酵母浸粉28，1(册〇428，1%3〇4.7!120 18，琼脂2(^、蒸馏水1，00〇1111^!1 自然；
[0018] 1.2.5不同氮源培养基筛选试验:在无氮培养基的基础培养基上分别加入2g酵母 浸粉(0.29g/L)、蛋白胨(0.29g/L)、牛肉膏(0.26g/L)、L-谷氨酸(0.19g/L)、硝酸钾(0.27g/ L)、脲(0.93g/L)和硝酸铵(0.69g/L)作为氮源筛选试验的7种不同水平，每个处理重复10次 并以无氮培养基作为对照，灭菌后将直径为〇. 8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培 养箱内30°C条件下恒温培养，接种Id后开始每天固定时间用划线法测量菌落直径、观察菌 丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后 停止记录；
[0019]无氮培养基：葡萄糖2(^，1(賊〇428，1%3〇4.7!120 18，琼脂2(^、蒸馏水1，00〇1111^!1 自然；
[0020] 1.2.6正交试验:对以上温度、PH、碳源和氮源四个单因素进行筛选，从各因素筛选 出3个水平进行四因素三水平的正交试验。在正交基础培养基的基础上按照正交表进行不 同培养基的制作，灭菌前用lmol/L HCL和lmol/L NaOH调节相应的pH值，将0.8cm的菌饼接 入相应的培养基中，分别移入相应的生化培养箱中按照相应温度恒温培养，接种Id后开始 每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝 直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后停止记录；
[0021 ] 正交试验基础培养基:MgS〇4 · 7H20 0.5g，KH2P〇4 lg，琼脂20g，蒸馏水lOOOrnL; [0022] 1.2.7最佳栽培料的筛选:设计了三种栽培种培养料配方进行试验对比，通过实验 结果筛选出三种配方中较好的配方，三种配方如下：
[0023] A:木肩76%，稻壳2%，玉米粉4%，麸皮15%，蔗糖1%，石灰1%，石膏1%，含水量 60-62% ；
[0024] B:木肩78%，稻壳2%，玉米粉17%，蔗糖1%，石灰1%，石膏1%，含水量60-62% ; [0025] C:木肩77%，麦麸20%，石灰1%，石膏1%，蔗糖1%，含水量60-62% ;
[0026]实验前一晚，将木肩稻壳和麸皮，比例称量，润湿一晚。次日按上述配方的不同比 例加入玉米粉、蔗糖、石灰和石膏。搅拌均匀后装入17cmX 33cm规格的聚丙烯袋中，培养料 的紧实度要适中，装袋高度约为14.5cm，重量约为0.65kg，将塑料打孔棒插入菌袋中心。每 个处理重复20个。装袋完成后，放入高温高压灭菌锅内，121°C条件下灭菌2h。灭菌完成后放 入超净工作台中紫外灭菌，冷却后进行接种，接种过程中将塑料打孔棒拨出，接入长满菌丝 的以高粱为基质的原种，然后塞入灭过菌的脱脂棉，移入出菇室中26-28°C条件下培养。记 录菌丝长势，色素产生情况和菌丝长满菌袋的天数，并根据相应文章查询出木肩、稻壳、玉 米粉、麦麸和蔗糖的含碳量和含氮量，对以上A、B和C配方的碳氮比进行对比分析；
[0027] 3结果与分析
[0028] 2.1温度试验
[0029] 在不同培养温度下，粗毛纤孔菌的菌落直径呈现出不同的生长状况（图1)，培养第 14天时，以30°C为培养条件的粗毛纤孔菌菌落直径大于同期培养在其他温度下的菌落直 径;在15°C-40°C的培养范围内，粗毛纤孔菌的菌丝均能生长，随着温度升高，其菌丝的生 长速度加快，但当温度过高时，反而抑制了菌丝的生长，40°C条件下培养的菌丝生长速度最 低；差异显著性检测结果表明，30°C和35°C对菌落直径的影响差异的显著性明显小于两者 与其他温度处理间的差异显著性；因此，该菌菌丝的适宜生长温度范围为30°C-35°C;
[0030] 粗毛纤孔菌在不同培养温度下培养至第14天时的菌落直径方差分析见表1，结果 表明，粗毛纤孔菌菌落生长速度在不同培养温度下差异较显著，详见图1;
[0031]表1温度方差分析表
[0032] Table 1 Variance analysis of Inonotus hispidus colony growth under the conditions of different temperatures.
[0034] 2.2初始pH试验
[0035] 在不同初始pH下，粗毛纤孔菌的菌落直径也呈现出不同的生长状况（图2)，由图可 以看出当pH在5.0-8.0范围内变化时，菌落直径差异较小，长势基本相同。pH为7.0和7.5时 的菌落直径与其他pH条件下的菌落直径相比较小;pH为8.5时，菌落直径最大，但菌丝前期 生长较慢，且菌落形状略不规则。其后依次为pH5.5、pH5.0、pH6.5、pH6.0和pH6.0;综合各因 素，在不同pH条件下，使粗毛纤孔菌菌丝生长旺盛色素产生状况较好的条件