一株抗衰老功能的粘膜乳杆菌的制作方法

文档序号:9744815阅读:799来源:国知局
一株抗衰老功能的粘膜乳杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于微生物领域,涉及新的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)菌株及 其益生功能,尤其是用于清除自由基和延缓衰老的功能。
【背景技术】
[0002] 肠道菌群作为虚拟"器官",影响着人体的发育生长、营养与健康,甚至其与代谢性 疾病(肠易激综合症,炎症性肠病,心血管疾病,糖尿病,肥胖等)密切相关,肠道菌群与人体 健康乃至长寿的关联性。
[0003] 湖南省浏阳市高田村地理位置相对封闭,其村民不仅长寿,而且普遍没有慢性疾 病。与此形成鲜明对比的是,周边地区既无长寿现象,而且心血管疾病,慢性肠胃炎和癌症 等疾病时有发生。
[0004] 乳酸菌可调节机体胃肠道菌群平衡,提高机体免疫力降低血清胆固醇,降血压,抗 氧化抑制肿瘤发生等方面的特殊生理活性。长双歧杆菌BBMN68分离自广西巴马长寿老人粪 便,其活菌液对便秘模型小鼠有润肠通便作用,提高免疫力。唾液乳杆菌FDB86可以缓解二 甲肼对肠道菌群的不良影响,使肠道菌群趋近于正常状态,对结肠癌大鼠肠道菌群变化的 调节作用。另外生物氧化是机体新陈代谢的重要生理过程,但此过程中会产生多种自由基, 自由基的累积,会照成体内氧化损伤逐渐增多,导致老年慢性病发生,而清除过多的自由基 可以延缓衰老。
[0005] 目前为止,没有报道任何粘膜乳杆菌物种的菌株对自由基的清除作用及延缓衰老 的功能。

【发明内容】

[0006] 现在,本发明人分离鉴定了一种粘膜乳杆菌ZDY308菌株,是一类厌氧,不产孢子的 革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状,在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色透明,圆形,光滑的菌落。 粘膜乳杆菌ZDY308可以在MRS肉汤培养基上生长,是革兰氏阳性菌。
[0007] 其对0.4%H202有较高的耐受能力,对羟基自由基,DPPH自由基,超氧阴离子,有高 的清除率,并且有强的总还原力。
[0008] ZDY308还可以提高衰老小鼠的血清和肝脏中抗氧化酶活性,降低血清和肝脏中有 害代谢产物(如:丙二醛)的含量,延缓小鼠的衰老症状。
[0009] 菌株对模拟胃液和模拟肠液有较好的耐受性。
[0010]本发明的粘膜乳杆菌ZDY308作为益生菌,不仅具有极强的清除自由基能力,且有 良好的耐酸耐胆盐性,能缓解D-半乳糖诱导小鼠的不良症状,延长小鼠寿命,促进宿主健 康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。
[0011] 本发明粘膜乳杆菌ZDY308(Lactobacillus mucosae ZDY308),于2015年9月28 日 保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学),编号:CCTCC NO:M 2015581。
[0012] 一种微生物菌剂,含有所述粘膜乳杆菌菌株ZDY308。
[0013]包含所述的粘I旲乳杆菌的乳制品、疏采制品及饮料制品。
[0014] -种组合物,包括所述的粘膜乳杆菌菌株,或通过所述的方法所获得的微生物菌 剂,或通过所述的方法获得的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。
[0015] 所述的组合物是食品,保健品或护肤品。
[0016] 本发明所述粘膜乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物,延缓衰老。
【附图说明】
[0017] 图1粘膜乳杆菌ZDY308发酵上清液,菌株和酸奶对DPPH自由基的清除能力 [0018]图2粘膜乳杆菌ZDY308发酵上清液,菌株和酸奶对羟基自由基的清除能力 [0019]图3粘膜乳杆菌ZDY308发酵上清液,菌株和酸奶对超氧阴离子的清除能力 [0020]图4粘膜乳杆菌ZDY308发酵上清液,菌株和酸奶的总还原力评价
[0021]图5粘膜乳杆菌ZDY308对模拟胃液的耐受性
[0022]图6粘膜乳杆菌ZDY308对模拟肠液的耐受性
[0023]图7粘膜乳杆菌ZDY308对肠上皮细胞HT-29的基因表达的影响
[0024]图8粘膜乳杆菌ZDY308对肠上皮细胞CaC0-2的基因表达的影响
[0025]图9粘膜乳杆菌ZDY308对D-半乳糖小鼠血清中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影响
[0026]图10粘膜乳杆菌ZDY308对D-半乳糖小鼠肝脏中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影响
[0027]图11粘膜乳杆菌ZDY308对D-半乳糖小鼠小肠基因表达的影响
[0028]图12粘膜乳杆菌ZDY308对衰老小鼠寿命的影响
【具体实施方式】
[0029] 以下结合实例来进一步解释本发明,但实施例仅用于说明本发明,而本发明的应 用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。
[0030] 实施例1:粘膜乳杆菌ZDY308的分离与鉴定
[0031]粘膜乳杆菌ZDY308是从健康长寿老人的粪便中分离。取lg粪便溶于10mL10%蛋白 胨溶液中,充分溶解,滤纸滤去残渣,滤液用5000rmp离心10min,弃去上清,收集沉淀,用lmL 1 〇 %蛋白胨水重悬。按1 %接种到MRS液体培养基中,过夜培养。培养液采用10倍梯度稀释, 梯度稀释为1〇'1〇'1〇'1〇'1〇'1〇'1〇'1〇 4和1〇'每个梯度取11^分别均匀涂布于 MRS肉汤的琼脂平板上,37°C厌氧培养48h。挑取单菌落,在平板上划线分离,反复进行纯化 培养,用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后,平 板培养,用接种环挑取单一的菌落作为模板,进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序。 [0032]将所分离菌菌株的16S rRNA碱基序列分析测序,结果:

[0034] 碱基序列进行比对分析,发现与数据库里的粘膜乳杆菌序列一致,并保存于武汉 市中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2015581。
[0035] 粘膜乳杆菌ZDY308菌株,是一类厌氧,不产孢子的革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状, 在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色透明,圆形,光滑的菌落。粘膜乳杆菌ZDY308可以在MRS肉 汤培养基上生长,是革兰氏阳性菌。
[0036]实施例2:菌株对氧胁迫的耐受性
[0037] 将新鲜培养的菌株以1%的比例接种到含0.4mmol/L H2〇2的MRS液体培养基中,37 °(3厌氧培养8h,分别测定Oh与8h的0D63Q,检测菌株对H2〇2的耐受性。
[0038]结果表明:A〇D>0.9,具有极强的耐受性。
[0039]实施例3:菌株和发酵上清液清除DPPH自由基能力
[0040] 按照接种量为1%接入MRS培养基中,厌氧37°C培养18h,6000r/min离心10min,分 别收集发酵上清液和菌体。菌体用PBS(pH7.2)溶液洗涤2次,再用PBS溶液重悬至乳酸菌数 为109cf u/mL。发酵上清和重悬的菌体作为清除自由基试验的样品。
[0041 ] 2mL样品中加入2mL DPPH无水乙醇溶液(0.2mmo 1 /L)混合均匀,室温避光反应 30min,6000r/min离心10min,取上清液于517nm处测定吸光度值Ai;空白组以等体积无水乙 醇代替DPPH无水乙醇溶液A。,对照组以等体积空白溶剂代替样品溶液Aj,并以等体积蒸馏水 和乙醇混合液空白调零。清除率(% ) = lOO-Ui-AcO/Aj X 100 [0042]实验结果:
[0043]如图1所示粘膜乳杆菌ZDY308发酵的酸奶对DPPH的清除率最高,超过80%,发酵上 清液和菌株对DPPH自由基也表现出较高的清除率。
[0044]实施例4
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