高耐受细胞株的筛选方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201210051119.2、申请日为2012年3月1日、发明名称为"高耐受 细胞株的筛选方法"的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本申请设及生物工程技术，特别是适合于大规模生产用的高耐受细胞株的筛选和 培养方法。
【背景技术】
[0003] 生物反应器在动物细胞规模化培养中的应用也是生物制药领域的发展趋势，很多 生物制药公司均致力于开发相关产品的发酵工艺，W满足公司产品能够在低成本大规模情 况下进行产品的制备。随着全球对生物制品的需求量的增大，生物反应器的规模也不断地 提高。此时，动物细胞大规模培养也就成了生物制药领域最重要的关键技术之一。
[0004] 但是，在发酵规模不断放大的过程中，细胞生长的微环境发生了很大的变化，细胞 生长受到显著影响，甚至导致细胞死亡。当细胞高密度生长达到一定程度，由于其自身特性 不同，其工艺参数耐受情况也不尽相同。随着细胞密度的增长，主要底物氧化还原代谢加 剧，传质及传热过程需要进行调整，加大揽拌及提高通气量是最主要的手段，伴随而来的是 细胞不可避免的受到的一系列物理损伤。底物的大量消耗会导致副产物的大量产生，对各 类细胞有较高的毒性，同时，底物耗竭会造成细胞生长代谢停滞进而导致大量细胞快速死 亡。
[0005] 因此，工艺参数是限制发酵规模的重要问题，各种工艺的开发依赖于细胞株能够 耐受微环境各项参数指标的变化，筛选获得能够在生物反应器中的高耐受细胞株显得尤为 重要。
[0006] 采用高耐受细胞株，不仅能够实现细胞株在无血清、无蛋白或者化学成分限定培 养基中的生长代谢和产物表达，同时，还能大幅度的提高细胞株的生长代谢机能，增强细胞 株抵抗微环境的各种恶劣变化，W此实现控制细胞增殖水平、延长细胞培养周期，解决规模 化放大参数的限制、降低成本等目标，进而提高规模化培养的效能。
【发明内容】
[0007] 本申请设及适合于大规模生产用的高耐受细胞株的制备和筛选方法。
[000引本申请的一方面提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，包括:选取可生长细胞株， 将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛 选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件 包括:细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或揽拌速度，或所述细胞培 养条件的两种或两种W上的任意组合。
[0009]在一些实施方式中，本申请的高耐受细胞株的筛选方法包括改变两种或两种W上 选自W下组的细胞培养条件:细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度W及 揽拌速度。在一些实施方式中，可改变Ξ种或Ξ种W上所述的细胞培养条件。在一些实施方 式中，可改变四种或四种W上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变五种或五种 W上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变六种或六种W上所述的细胞培养条 件。
[0010] 如果通过改变或调整多种细胞培养条件来筛选高耐受细胞株，所述细胞培养条件 可同时改变或调整，也可分先后分别改变或调整，也可W有些培养条件同时改变，有些培养 条件单独改变。例如，在一些实施方式中，可同时改变细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓 度、pH值、溶氧浓度W及揽拌速度，将细胞进行培养，挑选出适应于改变后的培养条件的高 耐受细胞株。在一些实施方式中，在细胞培养过程中可W按预定的顺序依次改变培养条件， 比如先改变渗透压，再改变乳酸浓度，再改变氨浓度，再改变pH值，再改变溶氧浓度，再改变 揽拌速度等，又比如先改变渗透压，再改变揽拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等，又比如 先改变渗透压和抑值，再改变揽拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等。在一些实施方式中， 在细胞培养过程中改变的细胞培养条件中至少有两种分别进行改变，即不是同时改变。例 如，在一些实施方式中，先改变初始细胞密度、渗透压、pH值和揽拌速度，然后再改变乳酸浓 度和氨浓度。
[0011] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步提高渗透压使得预定的细胞生 长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，W预定的梯度，比如50πιΩ或lOOmQ，逐步提 高渗透压。在一些实施方式中，培养液中初始的渗透压为大约280πιΩ或320πιΩ。在一些实施 方式中，培养条件中渗透压改变的范围为300~600mΩ。在一些实施方式中，培养液中渗透 压被一次性调整到预定的极限渗透压值，例如400mQ、500mQ或600mQ，直接筛选出可在极 限渗透压值条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。
[0012] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步降低溶氧浓度使得预定的细胞 生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，W预定的梯度，比如5%或10%，逐步降低 溶氧浓度。在一些实施方式中，培养液中初始溶氧浓度为80 %或70 %。在一些实施方式中， 培养液中溶氧浓度的范围在10%-80%、20%~80%、或者30%-80%。在一些实施方式中， 培养液中溶氧浓度被一次性调整到预定的极限溶氧浓度值，例如10%或15%，直接筛选出 可在极限溶氧浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。
[0013] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步提高乳酸浓度使得预定的细胞 生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，W预定的梯度，比如5mM、10mM、20mM、40mM 或80mM，逐步提高乳酸浓度。在一些实施方式中，培养液中初始乳酸浓度为OmM。在一些实施 方式中，细胞培养条件中乳酸浓度的改变范围为0~60mM，0~80mM，0~lOOmM或1~120mM 等。在一些实施方式中，培养液中乳酸浓度被一次性调整到预定的极限乳酸浓度值，例如 llOmM或120mM，直接筛选出可在极限乳酸浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受 细胞株。
[0014] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步提高氨浓度使得预定的细胞生 长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，W预定的梯度，比如2mM、4mM、6mM、8mM、 lOmM，逐步提高氨浓度。在一些实施方式中，培养液中初始氨浓度为OmM。在一些实施方式 中，细胞培养条件中氨浓度的改变范围为0~10mM，0~15mM，或0~20mM等。在一些实施方式 中，培养液中氨浓度被一次性调整到预定的极限氨浓度值，例如lOmM或20mM，直接筛选出可 在极限氨浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。
[0015] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是同时逐步提高乳酸浓度和氨浓度使 得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是 同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度W及渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度W及pH值使 得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。
[0016] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步提高抑值使得预定的细胞生长 参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，培养液中初始pH值为6.5。在一些实施方式中， 细胞培养条件中pH值的变化范围可W为6.5~7.8。在一些实施方式中，培养液中抑值被一 次性调整到预定的极限抑值，例如7.8,直接筛选出可在极限抑值条件下存活的、生长代谢 状态良好的局耐雙细胞株。
[0017] 在一些实施方式中，改变细胞培养条件可W是逐步提高揽拌速度使得预定的细胞 生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，W预定的梯度逐步提高揽拌速度，比如 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、lOOrpm、llOrpm、120rpm、ISOrpm、140rpm、 150巧m。在一些实施方式中，培养液初始揽拌速度为40巧m、60巧m、80巧m或10化pm。在一些 实施方式中，细胞培养条件中揽拌速度的变化范围可W为40~15化pm，40~20化pm，40~ 250rpm，或40~30化pm等。在一些实施方式中，揽拌速度被一次性调整到预定的极限揽拌速 度，例如2(Κ)巧m或3(Κ)巧m，直接筛选出可在极限揽拌速度条件下存活的、生长代谢状态良好 的高耐受细胞株。
[0018] 在一些实施方式中，可W在营养物低浓度条件下筛选高耐受细胞株。比如，营养物 浓度低于该细胞常规培养