一种培养转基因动物胚胎细胞或转基因动物的方法及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种培养转基因猴的方法及培养基。 技术背景
[0002] 动物疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中起到了关键作用。建立动物 模型的基因编辑方法主要有转基因和基因打祀。转基因即用人工方法将外源基因导入或整 合到基因组内，并能够稳定传给下一代。但依赖于病毒方法对动物进行遗传学修饰也有一 定的局限性，即被转入基因的随机插入使得突变位点无法预知，突变数量无法控制，从而限 制了动物模型的建立。而基因打祀技术是指通过内源性DNA定点重组，改变基因组中的某一 特定基因从而在生物活体内研究该基因的功能，如传统的同源重组技术、重组酶Cre介导的 位点特异性重组技术、锋指核酶技术（zinc-finger nucleases)、TALEN(1:ransc;ription activator-Uke effector nuclease)技术及近年W来备受关注的CRISPR/&s9技术等。
[0003] 传统的基因打祀技术依赖于胚胎干细胞系，首先在体外培养的胚胎干细胞系中进 行基因打祀，然后将打祀后的胚胎干细胞移植入动物母体，让其发育成带有突变基因的动 物。然而目前只有鼠的胚胎干细胞系可用于基因打祀技术。对于大多数物种，基因修饰仍依 赖于直接使用动物的胚胎细胞，效率低并且费用昂贵。提高胚胎细胞中基因修饰的效率是 成功建立动物疾病模型的关健。近年来发展的锋指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因 子核酸内切酶(TALEN)技术和基因编辑新技术CRISPR/Cas9等人工内切酶使得编辑任基因 组意位点的问题得W实现。TALEWlYanscription Activator-Like Effector Nuclease) 转录激活子样效应因子核酸酶技术，克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，W 及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，但TALE化蛋白分 子量过大往往会给分子操作带来不便，不但增大与祀基因结合难度，构建复杂，而且在生物 体内也可能产生其它影响。
[0004] 近两年发展出的CRISPR/Cas9技术使得在所有物种中实现基因组编辑成为可能。 CRISPR/tas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导化s9蛋白对基因进行编辑和修饰 的新技术。Jinek等对CRISPR/化s9系统进行人工改造使得该系统能够更简单方便地用于基 因编辑(Jinek et al. ,2013)，且能够实现将一对等位基因进行剪切得到纯合突变，还可在 目的基因的多个位点设计多种曲NAW完全敲除目的基因。目前，RNA介导的化s9系统能够成 功介导细菌、植物细胞、斑马鱼胚胎、小鼠、人源细胞、非人灵长类动物食蟹猴胚胎、甚至人 类废弃胚胎等的基因组编辑(Cho et al.，2013;Cong et al. ,2013;Jinek et al. ,2013; Mali et al.,2013;Niu et al.,2014;Platt et al.,2014;Shan et al.,2013)，为未来应 用于人类遗传缺陷疾病的治疗提供了希望。
[000引转基因技术及TALEN、CRISPR/Cas9等基因打祀技术的飞速发展使得动物疾病模型 的建立不再局限于少数的模式生物。但运些技术目前也都存在基因突变嵌合多态性、基因 敲入同源重组效率较低等不足之处。对于基因修饰的嵌合效应问题，小动物模型因生长周 期较短可通过不断杂交传代而得到纯合突变体。但对于大动物而言，如与人类较为接近的 灵长类动物，其性成熟时间就需要4到5年，妊娠时间长达165天，且目前尚缺乏有效的猴胚 胎干细胞系，因此嵌合效应的存在使建立纯合基因突变猴等大动物模型具有巨大挑战性。
[0006] 嵌合突变效应的发生可能由于注射的基因打祀RNA或者蛋白在受精卵胚胎分裂后 仍持续表达，或转基因病毒未能在单细胞胚胎时期稳定转入基因组从而导致胚胎细胞分裂 发育过程中一部分细胞的基因被修饰，一部分细胞仍维持野生型状态的嵌合现象，且在被 修饰的细胞中也可能会产生具有不同基因突变型的嵌合型突变体(Platt et al. ,2014; Sung et al.，2014;Kim et al.，2014)。例如单个受精卵细胞分裂成四细胞时，每个细胞基 因修饰的类型与程度会有所不一，所形成的胚胎组织及新生的动物会在不同的细胞或组织 中携带不同的基因修饰类型或有不同程度(单链或双链DNA)的基因修饰。此外，胚胎细胞分 裂过程中自身的DNA损伤修复机制或DNA非同源重组修复的不同一性等也会影响基因打祀 效率及嵌合效应。因此，改进或者发明能够克服运些基因修饰技术的嵌合性缺陷效应的方 法对高效建立纯合突变的动物疾病模型至关重要。
[0007] 胚胎分割是指用人工方法将植入前胚胎分割成两个或多个部分，分割后每个部分 可在适宜的培养条件下继续发育为完整胚胎，该技术的应用能够增加胚胎移植中的有效胚 胎数、提高妊娠率、增加克隆后代的数目。目前运一技术已在很多动物如小鼠、大鼠、猪、羊、 马等（Aston et al.,2008;Sc虹amm and Pap;rocki,2004;Tarkowski et al.,2010)哺乳动 物中广为应用，并且在灵长类动物中也得到证实。过去的研究发现，将恒河猴的2至化细胞阶 段的胚胎进行卵裂球分离，并将分离的卵裂球放入空透明带发育，重组胚胎可成功发育至 解化囊胚阶段(Mitalipov et al.,2002)<Xhan等（Chan et al.,2000)也在2000年对恒河 猴8八细胞期胚胎分割为四部分，其中两个卵裂球移植至受体后成功获得一只由1/4胚胎发 育而来的猴子Tetra，证明了早期胚胎分离后的卵裂球能够发育成正常的胎儿及新生猴。
[0008] 然而在上述实验中，由4-8细胞的胚胎分离出的卵裂球均含2个不同的胚胎细胞。 采用运样的卵裂球仍会制备出带有不同基因修饰体细胞的胚胎及新生动物。运是因为基因 修饰技术中所存在的嵌合性问题所导致的，即单细胞胚胎阶段所注射的基因打祀分子在细 胞分裂过程中不同细胞中发生不均匀的基因修饰效率。由于转基因 DNA及化s9mRNA的表达 和作用可能在4细胞胚胎阶段大为减弱，从4细胞胚胎分离出的单卵裂球继续分裂而形成的 胚胎应该是在每个单细胞携带相同的基因修饰类型。然而，目前尚未有研究报道灵长类动 物中由四细胞阶段胚胎分离而来的单个卵裂球能否在体外成功解化至囊胚阶段或者该四 细胞阶段胚胎来源的单卵裂球移植能否成功发育出小猴。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种能降低嵌合效应的胚胎培养方法及转基因动物的制备 方法。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种适用于上述方法的培养基。
[0011] 发明通过W下技术方案实现上述目的。
[0012] 首先，发明提供了一种能降低嵌合效应的胚胎培养方法。
[0013] 为解决目前动物模型建立中的嵌合效应问题，本发明提供了一种显著提高基因修 饰精准度的方法，即：将经基因修饰后的动物受精卵培育到四细胞阶段，去掉透明带，再去 掉细胞间连丝，将4细胞胚胎分离为4个单卵裂球，进一步再将单个卵裂球细胞放回到去除 胞质的透明带中，进行体外培养，从而提高基因修饰胚胎的纯合性。
[0014] 进一步的转基因动物的制备方法，则可W将上述单个卵裂球培育到二细胞到四细 胞期时，挑选合适的胚胎进行移植，W获得纯合的基因修饰动物模型。
[0015] 为降低嵌合性和提高基因修饰精准度，本发明可选地利用毛细管结合膜酶消化的 方法将四细胞阶段的动物胚胎(例如食蟹猴胚胎)分离为四个单卵裂球，再将运四个单卵裂 球细胞分别放回到四个空的透明带中，在优化的体外培养条件下将其培育至桑權胚或囊 胚。同时，本发明可选地采用单细胞PCR技术，能够分析每个单卵裂球细胞中的基因突变或 修饰类型与程度。经胚胎分割后的单卵裂球发育到四细胞或八细胞阶段时，能够显著增加 各个细胞中基因修饰类型与程度的相同性。利用本发明所述方法获得的胚胎可用于移植， 所获得的新生动物的毎个体细胞中将携带有相同的基因突变类型，从而能建立更能模拟因 基因突变所导致疾病的动物模型。
[0016] 实施方案可选地如下(流程如图6):
[0017] 1.将实施转基因操作后，发育至4细胞的动物胚胎分离为4个单卵裂球，并分别放 置于空透明带中；
[0018] 2.将胚胎转入优化的培养体系中；
[0019] 3.从重新发育至4细胞的胚胎中取出一个卵裂球；
[0020] 4.使用优化的PCR条件进行基因型分析；
[0021 ] 5.根据PCR结果筛选出适合移植的胚胎；
[0022] 6.胚胎移植，产出纯合的转基因动物。
[0023] 作为一个示例性实施例，本发明将基于CRISPR/Cas9基因修饰后的食蟹猴受精卵 单细胞发育到四细胞阶段，通过酸性台式液或碱性蛋白酶消化去掉透明带，并在不含化 2+， Mgh离子的膜酶中消化去掉细胞间连丝，毛细管机械分离4细胞胚胎卵裂球，再将单个卵裂 球细胞放回到去除胞质的透明带中，在优化的体外培养条件下:第一，运些再分化的卵裂球 可成功发育到囊胚;其次，可待发育到四细胞阶段时分出单个卵裂球利用单细胞PCR技术鉴 定基因打祀纯合突变率;第Ξ，待分化的卵裂球发育到二细胞到四细胞期时，挑选合适的胚 胎进行移植，W获得纯合打祀基因修饰猴模型。
[0024] 本发明成功