一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，治疗性抗体在临床上的应用越来越广泛。2000-2010年，抗体药物在全球 生物制药中所占份额从10.5 %扩张到56.41 %，预计2015年全球抗体药物市场规模有望达 至化80亿美元。抗体恒定区缺少核屯、岩藻糖基化的治疗性抗体目前正处于临床研究中，它们 在体外和体内都可W促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cellular c^otoxicity，ADCC)，运种生理活性引起人们广泛关注，并成为此类药物研究的 执占之一。 "、W、、、?^*^·^· 〇
[0003] 近年出现多种基因组编辑技术，主要有：锋脂核酸酶技术（zinc finger nuclease ,ZF化）、转录激活样效应核酸酶技术（transcription activator-Uke effector nucleases，TALEN)与RNA导向的CRISPR-Cas9核酸酶系统。CRISPR-Cas9核酸酶系统是近年 来发现并被广泛应用于真核细胞基因组编辑的一种技术。该技术利用化s9切割祀序列形成 双链断裂(DSB)，随后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复化DR)进而达到对祀基因 序列编辑的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物 中的应用。
[0005] 本发明首先保护一株重组细胞，即重组细胞CH0-Kl-EGFR-7gRNA。重组细胞CH0-Kl-EGFR-7gRNA是将CH0-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序 列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞;所述CH0-K1-EGFR细胞的制备方法如下:将产 品甲和产品乙共同导入C册-K1细胞，得到C册-K1-EGFR细胞;所述产品甲为如下（a)或（b): DNA分子甲；（b)含有所述DNA分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序 列1所示的轻链L4的DNA分子。所述DNA分子甲具体可为序列表的序列2所示的DNA分子或序 列表的序列2自5 '末端第9-729位核巧酸所示的DNA分子或序列表的序列2自5 '末端第85-726位核巧酸所示的DNA分子。所述重组表达载体甲具体可为在pcDNA-3.3载体的多克隆位 点（例如化ndm和Notl酶切位点之间）插入所述DNA分子甲得到的重组质粒。所述产品乙为 如下（C)或(d):DNA分子乙；（b)含有所述DNA分子乙的重组表达载体乙；所述DNA分子乙为编 码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。所述DNA分子乙具体可为序列表的序列4所示的 DNA分子。所述重组表达载体乙具体可为在pOptiVEC载体的多克隆位点（例如化nd虹和Notl 酶切位点之间）插入所述DM分子乙得到的重组质粒。
[0006] W上任一所述重组细胞C册-Kl-EGFR-7gRNA分泌的抗体（IgG)也属于本发明的保 护范围。
[0007] 本发明还保护所述抗体在制备用于杀伤肿瘤细胞的药物中的应用。所述肿瘤细胞 可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。
[0008] 本发明还保护一种用于杀伤肿瘤细胞的药物，其活性成分为所述抗体。所述肿瘤 细胞可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。
[0009] 本发明还保护所述抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。所述癌症可为表皮 癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。
[0010] 本发明还保护一种用于治疗癌症的药物，其活性成分为所述抗体。所述癌症可为 表皮癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。
[0011] 本发明对于癌症的治疗具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0012] 图1为巧tgRNA在化巧中祀标位置。
[001引图2为Western Blot的结果。
[0014] 图3为错配酶T7E1检测切割效率的结果。
[0015] 图4为细胞生长情况检测的结果。
【具体实施方式】
[0016] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0017] pSpCas9(BB)-2A-化ro载体：购自 addgene，目录号PX459。C册-K1 细胞:ATCC，(：化-61cCD C册 Medium:G化CO产品，目录号 10743-〇29D〇ptiMEM I Medium:G化CO产品，目录号 31985-070。脂质体（Fugene皿）：购于Promega公司，目录号E2311。嚷岭霉素：购于Gene Operation公司，目录号ISY1130-0025MG。西妥昔单抗(溶液形式：100mg/50ml，无色透明液 体，IgG抗体）：德国Merck公司，进口药品证号：S20050095,产品批号7667201dA431细胞(人 表皮癌细胞）：ATCC，C化-1555epcDNA-3.3 载体：Invitrogen公司，目录号 K8300-01。 pOptiVEC载体：Invitrogen公司，目录号 12744-017。
[001引轻链L4的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2自5'末 端第85-726位核巧酸所示。
[0019] 重链H3由重链可变区（VH)、重链恒定区1 (CH1)、较链区、重链恒定区2 (CH2)和重链 恒定区3(CH3)组成化3 = VH+CHl+hinge+C肥+CH3)。重链H3的氨基酸序列如序列表的序列3 所示，其编码基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1-145位氨基酸为重链可变 区（VH)，第146-243位氨基酸为重链恒定区1 (CH1)，第244-258位氨基酸为较链区化inge)， 第259-369位氨基酸为重链恒定区2(C肥），第370-475位氨基酸为重链恒定区3(C册）。
[0020] 实施例1、CH0-K1-EGFR细胞的制备
[0021] CH0-K1-EGFR细胞即表达抗EGFR人源化抗体L4册的CH0-K1细胞，其构建过程如下：
[0022] 1、将序列表的序列2自5'末端第9-729位核巧酸所示的双链DNA分子插入pcDNA-3.3载体的Hind虹和Notl酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-3.3-L4。
[0023] 2、将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pOptiVEC载体的化nd虹和Notl酶切 位点之间，得到重组质粒pOp t i VEC-册。
[0024] 3、将重组质粒PCDNA-3.3-L4和重组质粒p0ptiVEC-H3通过共转染的方式共同导入 C册-K1细胞，得到重组细胞，将其命名为C册-K1-EGFR细胞。
[00巧]实施例2、重组细胞的发现
[0026] 一、RNA 的设计
[0027] C册-K1-EGFR细胞中化t8基因的开放阅读框如序列表的序列5所示，包含9个外显 子，其中第1-203位核巧酸为外显子1序列，第204-319位核巧酸为外显子2序列，第320-482 位核巧酸为外显子3序列，第483-597位核巧酸为外显子4序列，第598-835位核巧酸为外显 子5序列，第836-1082位核巧酸为外显子6序列，第1083-1259位核巧酸为外显子7序列，第 1260-1410位核巧酸为外显子8序列，第1411-1728位核巧酸为外显子9序列。
[002引通过预实验，发明人设计了巧中gRNA如下（7种gRNA在化t8中祀标位置如图1所示）： 1gRNAl、1gRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、7gRNA和8gRNA。1gRNAl、lgRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、 7gRNA和8gRNA分别作用于化t8基因的第1个外显子、第1个外显子、第2个外显子、第5个外显 子、第6个外显子、第7个外显子与第8个外显子。1排NA1祀向序列表的序列5中第66-85位核 巧酸，lgRNA2祀向序列表的序列5中第182-201位核巧酸，2gRNA祀向序列表的序列5中第 278-297位核巧酸，5gRNA祀向序列表的序列5中第736-755位核巧酸，6gRNA祀向序列表的序 列5中第1005-1024位核巧酸，7gRNA祀向序列表的序列5中第1090-1109位核巧酸，8gRNA祀 向序列表的序列5中第1335-1354位核巧酸。巧中gRNA的祀标序列如表1所示。
[0029] 表1 7种gRNA的祀标序列
[0030]
[0032] 二、构建重组质粒
[0033] 分别合成单链DNA分子Oligo巧日单链DNA分子Oligo II，然后将上述两条单链DNA 分子进行退火，形成两端均具有粘末端的双链DNA分子，将双链DNA分子插入pSpCas9(BB)-2A-Pu;ro载体的抓si酶切位点得到重组质粒。
[0034] 表达IgRNAl的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Pur〇-