动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1,2-双加氧酶、其编码基因及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其设及一种动物粪便宏基因组来源的低溫邻苯 二酪1,2-双加氧酶、其编码基因及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 芳香族化合物是地球上仅次于碳水化合物的第二大类有机碳源，在自然界中广泛 存在。邻苯二酪是微生物代谢酪类和大多数多环芳香族化合物的中间产物，邻苯二酪的进 一步裂解对多环芳控是否能彻底降解起着重要作用。邻苯二酪1 ,2-双加氧酶（EC 1.13.11.1)是催化邻苯二酪邻位氧化开环的关键芳环加氧酶，该酶催化邻苯二酪裂解形成 中间物一一顺，顺-己二締二酸，并在后续酶促反应中进一步被降解进入Ξ簇酸循环，因此 邻苯二酪1,2-双加氧酶在微生物降解多种芳香族化合物的过程中有着重要作用。此外，该 酶催化邻苯二酪裂解形成的中间产物顺，顺-己二締二酸是一种精细化工原料，可用于生产 特殊性能的工程塑料、树脂、尼龙等，W及合成抗菌素、抗阻胺剂、乳化剂等。
[0003] 因此，近年来Acinetobacte;r[Lin et al .Protein J,2015,34(6) :421-433]、 Arthrobacter[Eck et al. Gen ,1993,123( 1):87-92]、Corynebacterium[Shen et al.Biotechnol Lett,2004,26(7):575-580]、Pseudomonas[Kim et al.J Basic Microbiol,2015,55(3):354-362;Kaneko et al.Chem Lett,2011,40:381-383]、 Rhodocococcus[Strachan et al.Biochem J,1998,333:741-747,Murakami et al.Gene, 1997,185(1):49-54]和Streptomyces[An et al.FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):17-22]等多种细菌的邻苯二酪1，2-双加氧酶基因相继被克隆、表达并鉴定。低溫邻苯二酪1，2-双加氧酶在低溫环境中具有较高的酶活，可用于低溫环境中芳香族化合物的降解，相对于 中溫或高溫邻苯二酪1,2-双加氧酶有其特有的应用优势。此外，将中溫或者高溫条件下顺， 顺-己二締二酸的生产过程转为低溫加工过程还可起到降低能耗的作用。然而，目前利用常 规微生物培养法从上述细菌克隆得到的邻苯二酪1,2-双加氧酶最适作用溫度一般为30~ 40°C，仅Pseudomonas SP.PAMC 25931来源的邻苯二酪1,2-双加氧酶的最适作用溫度为25 °C，但是该酶溫度稳定性较差，37°C下耐受化酶活完全丧失，25°C下耐受化酶活损失35% [Kim et al.J Basic Microbiol，2015,55(3):354-362]。
[0004] 动物尤其是植食性动物由于广泛摄食各种植物，其胃肠道是木质素及其相关酪类 物质降解的环境，同时通过环境互作对环境污染物的代谢，使得在长期进化过程中通过适 应和自然选择，其胃肠道中可能存在参与芳香族化合物代谢的功能基因。然而，传统的微生 物纯培养技术使得占微生物种类99% W上的不可培养微生物无法分离获得，因此通过分离 培养微生物来筛选新型酶的传统方法大大限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学避开 了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，为寻找和发现新的功能 基因及生物催化剂一一酶提供了新的研究策略。
[0005] 近年来利用宏基因组技术从环境中获取芳香族化合物代谢酶类的研究主要集中 在±壤、活性污泥和污水等环境样品，对动物胃肠道环境样品的研究匿乏[Beloqui et al.J Biol Chem,2006,281(32):22933-22942；Fang et al.PLoS One ,2012,7(11): e50312]，且未见有胃肠道来源的邻苯二酪1，2-双加氧酶的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种动物粪便宏基因组来源的低溫邻苯二酪1,2-双加氧 酶、其编码基因及其制备方法，本发明提供的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的最适作用溫度 较低，且溫度稳定性较好。
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种动物粪便宏基因组来源的低溫邻苯二酪1,2-双 加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共309个氨基酸，理论分子量为33.72kDa。
[0008] 本发明提供的动物粪便宏基因组来源的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶最适作用pH 为8.0，在抑7.0~9.0范围内处理化后，酶活剩余60% W上；最适作用溫度为25°C，具有低 溫酶的特性，在〇°C和10°C分别具有约30 %和60 %的酶活;该酶溫度稳定性较好，25°C和37 °〇条件下耐受化对酶活无影响，25°C条件下耐受26h仍保持65% W上的酶活。本发明提供的 动物粪便宏基因组来源的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶所具有的良好的pH、溫度稳定性和低 溫催化特性，可用于顺，顺-己二締二酸的酶法合成W及低溫环境中芳香族化合物的降解。
[0009] 本发明的目的之二在于提供一种编码上述技术方案所述的低溫邻苯二酪1,2-双 加氧酶的基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，基因大小为93化P。
[0010] 本发明的目的之Ξ在于提供一种包含上述技术方案所述的基因的重组表达载体， 优选为祀asy-E2-ca巧L12。
[0011] 本发明的目的之四在于提供一种利用上述技术方案所述的重组表达载体转化宿 主细胞所得的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽抱杆菌或乳酸杆菌， 优选为重组菌株化21(DE3)/ca巧L12。
[0012] 本发明通过PCR的方法克隆到邻苯二酪1,2-双加氧酶基因 catPL12,将基因 cat化12与质粒祀asy-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌化2UDE3)获得重组菌 株。
[0013] 本发明的目的之五在于提供一种上述技术方案所述的低溫邻苯二酪1,2-双加氧 酶的制备方法，包括W下步骤：
[0014] 将邻苯二酪1,2-双加氧酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养 重组菌株，诱导重组邻苯二酪1，2-双加氧酶表达；
[0015] 回收并纯化所表达的邻苯二酪1,2-双加氧酶，得到低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶。
[0016] 参见图1，图1是本发明实施例提供的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的制备方法流程 图。
[0017] 其中，所述邻苯二酪1,2-双加氧酶基因按照W下方法获得：
[001引从倭蜂猴粪便中提取微生物基因组DNA;
[0019] ^所述微生物基因组0麻为模板，^沈9 10^).3所示的引物〇曰巧1^2。和569 10 NO. 4所示的引物ca巧L12R进行PCR扩增，得到邻苯二酪1，2-双加氧酶基因。
[0020] 具体而言，所述邻苯二酪1,2-双加氧酶基因按照W下方法获得：
[0021] 从倭蜂猴粪便中提取微生物基因组DNA，其提取方法可参照专利"一种从动物粪便 中提取高分子量基因组的方法"，公开号102586234A;
[0022] ^所述微生物基因组0魁为模板，^沈9 10^).5所示的引物打2〇。和沈9 10^.6 所示的引物Ci2〇R进行PCR扩增。所述PCR反应参数为:94°C变性5min;然后94°C变性30sec，48 °C退火30sec，72°C延伸Imin，30个循环后72°C保溫7min。得到约43化P的基因片段，将基因 片段回收后与PMD19-T载体连接，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，获得邻苯二 酪1，2-双加氧酶基因片段Ci2〇15-d-13的核巧酸序列。
[0023] ^该邻苯二酪1，2-双加氧酶基因片段打2〇15-(1-13为核屯、序列，^569 10^.7所 示的引物此口1、56910側.8所示的引物此口2、56910側.9所示的引物此口3、56910側.10 所示的引物(15口1、569 10顯.11所示的引物(15口2和56〇10肋.12所示的