一种深海来源羧酸酯酶及其编码基因与应用

文档序号:9744897阅读:519来源:国知局
一种深海来源羧酸酯酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域,具体设及一种深海沉积物来源簇酸醋酶、其编码基因 及其应用。
【背景技术】
[0002] 脂类水解酶包括簇酸醋酶化C3.1.1.1)和脂肪酶化C3.1.1.3),广泛存在于微生物 中,能够催化醋类化合物的水解和合成。簇酸醋酶主要催化少于10个碳的短链酷基甘油,月旨 肪酶主要催化大于10个碳的长链酷基甘油。脂类水解酶具有许多优良特性,如催化反应不 需要辅助因子,手型选择特异性高,拥有较广的底物谱,W及在有机溶剂中保持高稳定性 等。脂类水解酶是工业生产中重要的催化剂,可广泛应用于手性药物催化、皮革絹纺原料脱 月旨、废水处理、洗涂工业W及食品加工等方面。
[0003] 目前已经有许多微生物来源的脂肪酶得到了商业化生产,并应用于生产生活的各 个方面。而簇酸醋酶作为一种重要的工业用酶,在实际生产中得到应用的种类和数量还十 分有限。新型簇酸醋酶资源的挖掘和积累是满足食品和化工等工业对簇酸醋酶日益增长需 求的必要条件。本发明运用宏基因组构建和簇酸醋酶活性筛选的技术,获得深海来源新型 簇酸醋酶,并研究其酶学性质。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种新的深海来源簇酸醋酶、其编码基因及其制备方法,该 簇酸醋酶可用于醋类降解及其他醋类化合物的生物催化和转化。
[0005] 本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中,ΚΞ下酸甘油醋作为底物筛选 簇酸醋酶活性,获得一种新的簇酸醋酶DMWn8-543,其编码基因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示,其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006] 将该簇酸醋酶序列在GenBank中进行同源捜索,与之相似性最高的也是宏基因组 来源的醋酶,相似性为81 % (其在GenBank数据库中的注册号为AFB82690)。系统发育分析结 果表明,簇酸醋酶DMWfl8-543属于脂类水解酶家族中的第IV家族。根据氨基酸序列推测,簇 酸醋酶DMWfl8-543的催化中屯、由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸(氨基酸位置为144、238和268)组 成,其中丝氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置为142至146) 组成的保守序列中,因此簇酸醋酶DMWfl8-543属于第IV家族GDSAG亚家族。氧离子桐位于75 和76位两个甘氨酸。综上所述,DMWfl8-543应为脂类水解酶第IV家族中的一名新成员。
[0007] 在不影响醋酶01胖門8-543蛋白活性前提下,可对569 10^:2所示的远离催化中 屯、氨基酸位置(优选142-146、238和268氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/ 或缺失一个或几个氨基酸获得具有醋酶DMWfl8-543活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的 公知常识,蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说,只有发生在功能 结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和Ξ维结构产生影响,从而影响其生物学活性。而 对于发生在远离功能结构域(优选远离142-146、238和268位氨基酸位置)的氨基酸位点,由 于运一区域不参与蛋白功能构象,因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产 生实质性影响,从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的醋酶DMWfl8-543突变体 具有至少与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%W上的同源性,更优选具有至少95%W上 的同源性,最优选具有至少99 % W上的同源性。
[000引同理,本发明还提供了编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基因序列,其与SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列一致;本发明还提供对SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列中除424-438、712-714和802-804位核巧酸外的其他核巧酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核 巧酸从而获得编码能基本保留醋酶DMWfl8-543蛋白生物学活性的突变体基因。优选的醋酶 DMWfl8-543突变体基因具有至少与SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列90%W上的同源性,更 优选具有至少95% W上的同源性,最优选具有至少99% W上的同源性。
[0009] 利用基因克隆技术,可将克隆到的醋酶DMWfl8-543基因连接到合适的载体上,并 转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组醋酶DMWfl8-543。合适的原核生物宿 主包括各种细菌如E.coli等,合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞 (如中国仓鼠卵巢细胞)等,优选采用原核表达系统E.coli。
[0010] 合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载 体,原核表达载体如祀T系列载体,P犯系列载体;酵母表达载体pPICZ-a-A,pHIL-D2,PPIC9, pHlX-Sl(Invitrogen Co巧.San Diego. California.USA);动物细胞表达载体pSVK3、pMSG (Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。一个优选的例子是将本发明筛选到簇酸醋酶 DMWfl8-543的编码基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(Novagen)上,并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)中,经诱导表达出高活性的重组醋酶。
[0011] 本发明还提供了簇酸醋酶DMWfl8-543或能表达簇酸醋酶DMWfl8-543的宿主菌在 工业上的应用,例如可用于催化醋类水解。通过醋酶活力测定表明,簇酸醋酶DMWfl8-543或 上述能表达簇酸醋酶DMWfl8-543的宿主菌可用于水解短链脂肪酸醋,例如C2-C8短碳链脂 肪酸醋。优选的短链脂肪酸醋为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酪醋,例如对硝基苯酪乙酸 醋、对硝基苯酪下酸醋、对硝基苯酪己酸醋或对硝基苯酪辛酸醋等,其中底物为对硝基苯酪 下酸醋(C4)时催化活性最高,酶活达444U/mg。
[0012] 簇酸醋酶DMWfl8-543催化水解溫度范围为15~55°C,优选为30~45°C;所述水解 的pH值为5.0~10.0,优选为6.0~8.0。在20°C W下保溫2.化,可保持80% W上的残余酶活; 在30°C和40°C中保溫2.化,可保持50%和37% W上的残余酶活。本发明提供的新型簇酸醋 酶及其编码基因在医药制备、食品加工及风味改良、废水处理、洗涂行业具有重要的应用潜 力。
【附图说明】
[OOU]图巧纯化簇酸醋酶DMWfl8-543的聚乙酷胺凝胶电泳分析图。
[0014] 图2为簇酸醋酶DMWfl8-543的底物特异性图。C2:对硝基苯酪乙酸醋;C4:对硝基苯 酪下酸醋、C6:对硝基苯酪己酸醋;C8:对硝基苯酪辛酸醋;CIO:对硝基苯酪癸酸醋;定义底 物为C4时测定值为100 %。
[0015] 图3为簇酸醋酶DMWf 18-543最适反应溫度图。
[0016] 图4为簇酸醋酶DMWfl8-543最适反应抑图。
[0017]图5为二价阳离子对簇酸醋酶DMWfl8-543棘性影响图。
[001引图6为有机溶剂和去垢剂对簇酸醋酶DMWf 18-543活性影响图。
[0019] 图7为簇酸醋酶DMWfl8-543的溫度稳定性图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1簇酸醋酶DMWf 18-543编码基因的获取
[0021] 深海沉积物样品由深海可视多管取样器采集自太平洋海山边缘。宏基因组文库构 建采用CopyControl? HTP fosmid library production kit(Epicentre Biotechnologies,美国),宿主菌株为E. coli EPI30(KEpicentre Biotechnologies,美 国),载体为pCC2F0S fosmid vector化picenhe Biotechnologies,美国)。经脉冲场电泳 检测,插入片段大小为36~48化。取10μ1文库菌液稀释至10化1,涂布于簇酸醋酶筛选平板, 30°C培养2天。培养基配方为LB培养基(lOg/L膜蛋白腺,5g/L酵母抽提物,lOg/L氯化钢,pH 7.2);灭菌后,无菌条件下加入氯霉素,使其终浓度为12.5yg mri。
[0022] 挑取单克隆并打包,对fosmid打包文库进行测序,拼接后预测开放阅读框并注释 基因,从中筛选脂类水解酶相关基因。通过Blasts化ttp://blast .ncbi .nlm.n;Lh.gov/)比 对序列与数据库中已知醋酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得DMWfl8-543编码基 因,大小为 909bp,碱基组成为:148A(16.28%)、146T(16.06%)、327C(35.97%WP288G (31.68%),其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示。编码蛋白大小为302个氨基酸残基,其氨基 酸序列如SEQ ID No:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源捜索,与之相似性最高的 簇酸醋酶也为宏基因组,相似性为81 %,其在GenBank数据库中的注册号为AFB82690。
[0023] 系统发育分析结果表明,簇酸醋酶DMWfl8-543属于脂类水解酶家族中的第IV家 族。根据氨基酸序列推测,簇酸醋酶DMWfl8-543的催化中屯、由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸(氨 基酸位置为144、238和268)组成,其中丝氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨 酸(氨基酸位置为142至146)组成的保守区域中,因此簇酸醋酶mwn8-543属于第IV家族 GDSAG亚家族。而氧离子桐位于75和76位两个甘氨酸。
[0024] 综上所述,DMWf 18-543应为脂类水解酶第IV家族中的一名新成员。
[00巧]实施例2簇酸醋酶DMWf 18-543的重组表达质粒和重组菌株的构建
[0026] 将本发明获得的簇酸醋酶DMWf
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