一种巯基蛋白酶的提取方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种琉基蛋白酶的提取方法。
【背景技术】
[0002] 木馨淀粉磁性微球是W磁性Fe3〇4及天然高分子物质木馨淀粉为原材料的一种可 生物降解功能材料。目前，国内外研究大多采用合成高分子材料为壳制备高分子磁性微球， 而W天然高分子物质木馨淀粉为原材料，相对于合成高分子材料具有可降解性、无毒性、生 物相容性、环境友好且来源丰富等特点。高分子磁性微球既具有高分子的特性，可通过交 联、共聚、接枝、表面改性等赋予其多种性能。高分子磁性微球又因具有磁响应性，在外加磁 场作用下可迅速分离，且操作简便，至今，在生物分离如细胞分离、标记、核酸排序等，生物 医学如祀向给药、临床诊断，和生物工程如作为载体酶的固定化等方面得到快速的发展。近 年来，磁性高分子微球的特殊性能和其显示的广阔应用前景受到人们的广泛关注，使得高 分子磁性微球在多个领域显示出强大的生命力，已渗透到分离工程等许多领域。
[0003] 琉基蛋白酶是指一类活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并且依靠琉基催化水解肤键 的蛋白水解酶，包括溶菌酶、渡萝蛋白酶和木瓜蛋白酶等。W木瓜蛋白酶为例，其可水解多 肤中赖氨酸、精氨酸和蛋白质的簇基端，是一种可食用的活性半脫氨酸蛋白酶。它具有天 然、卫生安全、酶活高且热稳定性好等特点，不仅在广泛应用于食品、饲料、日化等方面，在 医药、皮革及纺织等行业也有了一定的应用，目前主要应用于肉的嫩化和啤酒的澄清等。木 瓜蛋白酶主要存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中，其含量在未成熟的乳汁中最丰富。由于 木瓜蛋白酶为天然产物，如何从植物中更快更好的分离成为科研工作者们的研究热点。
[0004] 目前提取木瓜蛋白酶的技术多样，主要包括亲和层析法、超滤法、有机溶剂法、盐 析法、絮凝法和喷雾干燥法等。亲和层析法分离得到的酶纯度高，但前处理液需进行初步纯 化，且层析法操作过程繁琐，不易进行工业化生产;超滤法因木瓜蛋白酶为大分子物质，在 超滤过程中易聚积在膜表面，产生浓差极化现象，导致超滤速率下降；有机溶剂法程序复 杂，过程采用了大量的机物质，易产生有机溶剂残留和木瓜蛋白酶易变性等问题;盐析法使 用大量的盐，产生较大灰分，易使酶变性，得到产品的活性较低;絮凝法由于其专一性不强， 分离得到的木瓜蛋白酶含较多杂质，纯度不高;喷雾干燥法易发生木瓜蛋白酶粘结在容器 壁导致活性降低等问题。
[0005] 文献《功能纳米颗粒对木瓜蛋白酶吸附动力学及热力学研究》报道利用壳聚糖磁 性微球吸附分离木瓜蛋白酶，但是其对木瓜蛋白酶的平衡吸附量较低。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中琉基蛋白酶分离过程复杂，步 骤繁多，而提供了一种琉基蛋白酶的提取方法。本发明的分离方法操作简单，时间短，设备 要求简单，且平衡吸附量较高。
[0007] 发明人经过试验创造性地发现将木馨淀粉磁性微球应用于琉基蛋白酶的吸附分 离，运用磁性分离技术，在短时间内实现快速分离，可将许多烦琐复杂的操作简单化，使传 统测试的周期大大缩短。
[0008] 本发明提供了一种琉基蛋白酶的提取方法，其包括W下步骤：（1)将木馨淀粉磁性 微球，与含有琉基蛋白酶的溶液混合后进行振荡吸附；（2)将步骤（1)的反应液进行磁性分 离后，将木馨淀粉磁性微球进行洗脱，即可。
[0009] 本发明所述的琉基蛋白酶是指本领域中的一类活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并 且依靠琉基催化水解肤键的蛋白水解酶，一般包括溶菌酶、渡萝蛋白酶或木瓜蛋白酶等。
[0010] 步骤(1)中，所述的振荡吸附的方法优选静态吸附法。所述的振荡吸附优选采用恒 溫摇床进行振荡吸附。所述的振荡吸附的转速可参照本领域的常规进行选择，本发明优选 100~2(K)r/min，更优选15化/min。所述的振荡吸附的溫度可参照本领域的常规进行选择， 优选20~45°C，更优选25~40°C;进一步优选30~35°C。所述的振荡吸附的时间可为使所述 的振荡吸附的吸附量趋于平衡，即可;例如当所述的木馨淀粉磁性微球的用量为〇.2g，琉基 蛋白酶为木瓜蛋白酶，且所述的含木瓜蛋白酶的溶液为20mL，所述的木瓜蛋白酶浓度为 Img/mL时，所述的振荡吸附的时间优选10~300min，例如：20min、30min、40min、50min、 60min、70min、80min、90min、100min、120min、150min、180min 或 240min，更优选 60min;又如， 当所述的木馨淀粉磁性微球的用量为1.2g，琉基蛋白酶为溶菌酶，且所述的含溶菌酶的溶 液为20mL，所述的溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，所述的振荡吸附的时间优选10~300min，例 女日：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、lOOmin、120min、ISOmin、 ISOmin 或 240min，更优选 ISOmin。
[0011] 步骤（1)中，所述的木馨淀粉磁性微球的用量可为本领域常规的可将所述的琉基 蛋白酶吸附，即可;本发明中所述的木馨淀粉磁性微球与所述的琉基蛋白酶的质量比优选 2.5:1~12.5:1，更优选5:1~12:1，进一步优选7.5:1~10:1。
[0012] 步骤（1)中，所述的含有琉基蛋白酶溶液优选为将琉基蛋白酶溶于化is-HCl缓冲 液中得到的含有琉基蛋白酶溶液;所述的含有琉基蛋白酶溶液的pH值优选5~10,更优选6 ~9,进一步优选7~8.5,更进一步优选7~8;所述的含有琉基蛋白酶溶液中琉基蛋白酶的 浓度优选0.5~Img/mL。
[0013] 步骤(2)中，所述的洗脱的洗脱液可W为本领域常规的可将琉基蛋白酶从木馨磁 性微球上洗脱下来的洗脱液，本发明优选为：pH为4.5~6.5(更优选pH为5)，且含0.9~ 1. Imol/L(优选1.0mol/L)NaCl的醋酸和醋酸盐缓冲液;所述的醋酸盐优选醋酸钢。
[0014] 木馨淀粉磁性微球吸附含琉基蛋白酶的吸附原理可为:淀粉上裸露的活泼径基的 亲水性，和淀粉对蛋白酶的亲和性，木馨淀粉中含有0.07 % -0.09 %的憐，对酶具有亲和作 用；淀粉磁性微球中的四氧化Ξ铁磁性粒子中的铁带正电荷，能够与酶中琉基中孤对电子 产生静电作用吸附，从而实现了蛋白酶的吸附分离。
[0015] 在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳 实例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于：（1)采用磁性分离技术，实现固液快速分离。木馨淀 粉磁性微球可作为亲和吸附材料，通过静电作用或配位作用与木瓜蛋白酶结合，对木瓜蛋 白酶的吸附率可W达到23.98~47.22%，采用磁性吸附进行快速分离。洗脱得到解吸率为 88.56~91.48%，测得相对酶活为60.21 %~69.7%。（2)利用木馨淀粉磁性微球吸附分离 溶菌酶额的吸附量可为5.87mg/g，吸附率可为73.42%; (3)木馨淀粉磁性微球为环保型吸 附剂，具有无毒、无污染，对环境友好。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0019] 本发明【具体实施方式】部分设及的木馨淀粉磁性微球均参照文献木馨淀粉磁性微 球的制备及表征，食品科技，2014，39(6)，242-246制备得到。
[0020] 实施例1
[0021] 步骤(1)W木馨淀粉磁性微球为吸附剂，木瓜蛋白酶为模型蛋白，采用静态吸附法 进行吸