一种妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌。
[0002]
【背景技术】
[0003]妊娠特异性糖蛋白(PregnancySpecific Glycoprotein, PSG)是一种胎盘多肽，自1971年德国科学家Bohn从人胎盘中分离提纯以来，各国学者对其进行了广泛的研究。发现PSG与早孕并发症、宫内胎儿生长状况及消化道肿瘤疾病关系密切，对临床上相关疾病的诊断具有指示作用。日本学者报道妊娠特异性糖蛋白l(Pregnancy SpecificGlycoprotein I，PSG1)可在子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和和胃肠道恶性肿瘤患者的血中测出，进一步研究证实癌细胞浆中存在有PSGl的患者比没有PSGl患者存活时间短。近年来对妊娠特异性糖蛋白3(Pregnancy Specific Glycoprotein 3，PSG3)的研究受到广泛关注。PSG3是癌胚抗原(CEA)家族的成员，PSG3蛋白全长428个氨基酸，在胚胎发育的过程中同胚胎期免疫耐受的建立以及血管生成有关，同时该指标可应用于消化道肿瘤的诊断。
[0004]对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，这些方法本身变异性较大，因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。但实验室现有的PSG3检测试剂无标准品。而天然PSG3抗原在胎盘中含量又低、来源有限且纯化过程较为繁琐因此建立一种经济、高效的基因工程方法制备PSG3标准品蛋白就显得尤为重要。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种制备PSG3标准品的重组菌及方法。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
一种制备妊娠特异性糖蛋白3标准品的方法，包括如下步骤:
(I)构建重组菌:将妊娠特异性糖蛋白3的编码基因连接入基因的表达载体中，并将构建好的基因表达载体导入宿主大肠杆菌菌体中，构建重组菌;其中，编码妊娠特异性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008](2)重组菌发酵诱导培养:将重组菌用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行发酵诱导培养，得到发酵液；
(3)蛋白纯化:将诱导后菌体破碎，取沉淀;经蛋白纯化即可得重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白洛液；
(4)蛋白标准品的获得:向重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组妊娠特异性糖蛋白3标准品。
[0009]本发明所述的方法，步骤(I)所述基因的表达载体为ρΕΤ_30α。
[0010]本发明所述的方法，步骤(I)所述宿主大肠杆菌为Ε.coliJM109(DE3)。
[0011]本发明所述的方法，步骤(2)所述发酵诱导培养使用含标记物的LB培养基进行克隆培养。
[0012]本发明所述的方法，所述标记物为卡那青霉素。
[0013]本发明所述的方法，步骤(3)所述蛋白纯化包括变复性纯化、阴离子交换层析纯化步骤。
[0014]利用权利要求1至6任一所述的方法制备的标准品，所述妊娠特异性糖蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0015]—种用于制备妊娠特异性糖蛋白3标准品的重组菌，所述重组菌是将妊娠特异性糖蛋白3的编码基因连接入基因的表达载体中，并将构建好的基因表达载体导入宿主大肠杆菌菌体中得到的，且所述重组菌的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016]本发明所述的重组菌，所述基因的表达载体为ρΕΤ_30α。
[0017]本发明所述的重组菌，所述宿主大肠杆菌为Ε.coliJM109(DE3)。
[0018]本发明的有益效果在于:
目前国际国内均没有重组PSG3的标准品，本发明提供一种重组PSG3蛋白生物学活性检测用标准品的制备方法，为建立重组PSG3蛋白质量标准奠定基础;SDS-PAGE鉴定其纯度为98%，相对分子量46kD，HPLC鉴定其纯度为99.32% ；此外，本发明制得的重组PSG3的标准品为冻干制剂，2?8°C可长期保存，在低于25°C室温下可保存两年。
[0019]
【附图说明】
[0020]图1为本发明重组PSG3的SDS-PAGE检测结果图:
其中，泳道M:蛋白Marker ；泳道I:纯化后重组PSG3蛋白；
图2为本发明重组PSG3的HPLC C18反相层析C蛋白纯度检测结果图。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0023]1.构建重组菌:将PSG3的编码基因连接入基因的表达载体ρΕΤ_30α中，并将构建好的基因表达载体pET-30a-PSG3导入宿主大肠杆菌E.coli JM109(DE3)菌体中，构建重组菌JM109(DE3)/pET-30a-PSG3;其中，编码PSG3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，PSG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，重组菌的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0024]2.PSG3蛋白溶液的制备
(2-1)将重组PSG3工程菌接种到含有卡那青霉素的LB固体培养基上，37°C恒温培养12?24h，挑取克隆接种于3-5ml的LB培养基中，37°C恒温摇床培养至OD6qq达到1.5?1.8，转速为220r/min；
(2-2将(2-1)获得的菌液1:100接种到100-2001111的1^培养基中，37°(3恒温摇床培养至OD6OQ达到1.5?1.8，转速为220r/min，得到发酵种子液；
(2-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为20min;
(2-4)将发酵种子液1:100接种于发酵罐中LB培养基上，设置温度为37°C、溶氧为30%、转速为220?270r/min、pH为7.2??.4条件下发酵;当发酵罐内的OD6qq达到1.0~1.2时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为lmmol/L，调温度至32°C，诱