一种冷激表达型t载体及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及适用于分子生物技术、微生物工程、基因工程等技术领域的I种新型T载体，更具体涉及I种通过冷激诱导的低温表达型T载体的结构、性质及应用技术。
【背景技术】
[0002]利用遗传工程来生产目标蛋白的技术已经得到广泛应用。其中，大肠杆菌{Escherichia coli)表达系统由表达载体和相应的宿主细胞两部分构成,是发展最早、应用最广、最容易操作的基因高效表达系统。在大肠杆菌表达系统中，表达载体通常运用可调控型启动子控制外源基因的表达；这些启动子的类型对降低被表达的目标蛋白对细胞生长的抑制、减少细胞蛋白酶对目标蛋白的降解，以及目标蛋白的产量和可溶性等起着至关重要的作用。因此，所用启动子的性质决定了相应表达载体的生产效率和应用潜力。经过二十多年的发展，一些具有不同类型启动子的表达载体已经被广泛应用于科学研究和商品蛋白的生产过程。研究和应用最多的代表类型是带有lac、trp、tac、gal、ara和T7启动子；其中，T7系列载体因表达水平高而广为应用。最近几年发展起来的启动子类型主要包括由Sigma因子(σ 32)调控的热激诱导型启动子Hsh，以及适用于低温表达的冷激蛋白基因的启动子。
[0003]在对数生长期，将大肠杆菌细胞的培养温度从37°C下调至10?20°C的过程称为冷激。细胞中有一组基因对冷激过程发生应答反应，它们受冷激诱导，表达产生一类冷激蛋白(CSP);根据表达水平提高的倍数冷激蛋白被分为组I (10倍以上)和组II (低于10倍)。组 I 中的蛋白包括 CspA、CspB、CspG 和 CsdA (GraumannP et al., Mol Microboil,1997，25 (4):741 ?756)。由于 CspA (W090/09447)的表达水平在温度从 37°C 降至 10°C后的1.5小时之内达到细胞总蛋白的13% (Joel et al., PANS, 1990，87: 283-287)，所以，a#基因的启动子已经被用于应表达载体，在低温下控制基因的重组表达(Qing etal., Nature B1technol, 2004, 22(7): 877-882)。研究发现，用冷休克蛋白启动子构建的基因表达载体(如PCold等)能够表达很多T7系列载体不能表达的基因，也能够使一些在T7中产生包涵体的基因实现可溶性表达。
[0004]将待克隆的DNA片段成功连接到载体DNA，是目标克隆克隆和筛选，进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达和测定蛋白质结构与性质等研究工作的首要步骤。TA克隆技术采用另一种方式进行粘性末端连接:7?^/ DNA聚合酶扩增产生的PCR产物的双链两端各带有I个3’端悬挂的A (腺苷酸)，能够与末端带有T (胸腺核苷酸)的载体进行连接(Holto et al., Nucleic Acids Res, 1991，19:1156)。因为 TA 克隆中每一段线性DNA的两端序列不能相互配对，从而避免目标基因片段之间的相互连接或载体的自身环化。
[0005]目前市场上销售的T载体的应用效果不够稳定，因为T核苷酸并非TaqDNA聚合酶优先聚合的核苷酸，仅部分载体的3’端能添加上T，并且有些末端可能被加上过多的T。市售T载体的另一个欠缺是缺乏基因表达功能，PCR产物克隆成功后，还需要用限制性内切酶切下目的片段，亚克隆到经同样酶切处理的表达载体中，才能进行基因的超量表达研究。因此通常T载体只能作为中间载体，后续还要进行一系列繁琐的操作。
[0006]钟星等最近发表了关于构建I种用于基因克隆和表达的定向T载体pETG的研究论文(钟星等，生物工程学报，2012，29: 510-519)。该论文在构建自制的可用于基因表达的T载体方面，以及TA克隆的定向选择方面为基因工程工作者提供了有效的方法。虽然表达型T载体pETG在目的基因的克隆表达时结合了 TA克隆技术，但是由于它来源于T7系列载体PET，多数蛋白的活高效表达同样会遇到诱导剂、细胞毒性、产生包涵体等方面的问题。同时，PET载体比较大，不利于对目标基因进行原位诱变改造和筛选。
[0007]本发明结合大肠杆菌冷激蛋白启动子在低温下的高效可溶性表达的优势和TA克隆技术的优势，首次设计并构建I种兼有克隆、冷激诱导表达和低温下目标基因活性筛选等多种功能的高效T载体，PEXC-T0外源基因通过TA克隆技术连接到线性载体pEXC-T上产生环状表达质粒，转化方.cWi后可以使目标基因在新型冷激表达系统PEXC中得到高效表达。
【发明内容】
[0008]1.发明目的
常温生物的基因在进行异源表达时，所编码的蛋白质不够稳定，多数蛋白在表达后很快变性；还有一些生物活性蛋白在胞内表达后对宿主细胞的生长产生抑制或毒害作用，因而难以进行基因克隆和表达。为了解决蛋白变性或毒性问题并进一步提高克隆效率，本发明设计并构建一种具有以下特征的新型T载体:(I)在低温环境下表达外源基因，能够有效防止蛋白变性或降低细胞毒性；(2)质粒分子小，具有基因容量大、转化率高等特点，能够提高基因克隆效率；(3)质粒拷贝数高，进一步提高表达水平；(4)构建为T载体，结合TA克隆技术和低温表达功能，适用于文库构建和活性筛选。
[0009]2.本发明的具体描述本发明的设计方案:
本发明的质粒PEXC-T载体的构建以表达载体pHsh-Cm为基础。首先我们设计了新型T载体的前体质粒。前体质粒中保留了 PHsh-Cm中的氯霉素抗性基因和来源于pUC18/19的拷贝数>200的复制元件、消除了质粒复制元件中的I个限制性内切酶I识别位点、删除Hsh启动子和多克隆位点、插入了 I个大肠杆菌a#启动子及其终止子，并且在启动子和终止子之间插入两个I识别位点。前体质粒为环状，转化大肠杆菌后在细胞中可以得到大量复制；用3/〃 I酶对前体质粒进行切割后，即可获得本发明的T载体(图1)。
[0010]实现本发明的操作技术:
(I)选择合适的目标载体和限制性内切酶。
[0011]首先，选择合适的目标载体进行改造，本发明选择的是本研究组构建的新型大肠杆菌高效表达载体pHsh-Cm (GenBank登录号:FJ571620)。再选择合适的限制性内切酶，所选择的限制性内切酶位点在载体上应该尽可能的稀有，更重要的是酶切以后要在线性化载体的两端各留下I个3’端悬挂的碱基T。限制性内切酶I的识别和切割的序列是:5’ -G TATCCN NNNNNN N-3’，其中，“N”为A、T、C或G任意碱基。将酶切位点的碱基设计成5’-G TATCCN NNNNAN N_3’，切割后可以产生3’端悬挂T的末端(图2)。因为Bfu I的识别和切割位点是非对称性的，因此，正负链上各设置I个I位点就可以产生两端带有3’端突出T碱基的线性化载体。
[0012](2)突变目标载体
通过反向PCR方法对选定的目标载体进行定点诱变,消除目标载体上的方/?/ I酶切位点。这里及以下涉及的限制性内切酶及DNA修饰酶的使用、基因克隆、大肠杆菌转化等相关操作的具体方法均按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行的(Sambrook andRussell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
[0013](3)切除多克隆位点及启动子的更换
诱变消除Bfu I酶切位点完成后，对载体再次进行去除Hsh启动子和多克隆位点，然后通过融合PCR引入启动目的基因表达的启动子cspA启动子以及相应的转录终止子；通过融合PCR技术在启动子和转录终止子之间引入2个方/yI酶切位点，从而形成如下结构:csppromoter......RBS......NF...Bfu 1......Bfu 1..His-Tag......;该质粒为 pEXC-T 的前体质粒。
[0014](4)制备新型低温冷激诱导表达的T载体。
[0015]将上述前体质粒导入大肠杆菌细胞，培养细胞后进行质粒的提取纯化；用份1/ I对纯化的环状前体质粒进行切割后，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收，所获得的2 478 00bp线性DNA片段即为具有低温冷激表达元件、3’末端带T的载体；这种新型T载体被命名为pEXC-T (图1)。冷激启动表达的T载体中的抗药基因，可以通过环状质粒扩增法(PPCP)对前体质粒进行更换。
[0016](5)冷激诱导高效表达的条件优化
以β -D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)为报告基因，克隆构建质粒pEXC_lacZ，将其转化至大肠杆菌DHlOB UacZ缺陷)宿主菌种，并研究诱导表达的温度、冷激诱导的时机以及诱导后的表达时间长短对外源蛋白表达的影响，通过检测β -D-半乳糖苷酶酶活来找到最佳的表达条件。
[0017]本发明可取得的有益效果:
本发明产生的新型载体PEXC-T在使用方法、作用功能和应用效果等方面优于一般低温表达载体、商业化T载体或最近报道的T载体。pEXC-T是一个多功能载体，不仅能用于基因的快速克隆测序，还能直接进行基因低温高效表达；更重要的是它能够有效解决蛋白质的变性和细胞毒性问题，以及一些产生包涵体蛋白的重组表达问题。本发明的主要有益效果总结如下:
1.市场上销售的T载体是PCR克隆载体，缺乏基因表达功能，经过克隆和序列测定的基因还需要亚克隆到其他表达型的载体如PET系统中，才能获得基因产物的高水平表达；pEXC-T仅需I次TA克隆就可以获得目