Ots2蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种0TS2蛋白及其编码基因在调控植物对ΑΒΑ耐 受性中的应用。
【背景技术】
[0002] 脱落酸(abscisic acid,ΑΒΑ)是一种重要的植物激素，早在20世纪60年代初被人 们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素脱落酸(ΑΒΑ)在植物生长发育 的各阶段都发挥重要作用，例如种子休眠、种子萌发、幼苗生长、气孔运动W及营养生长向 生殖生长转换等过程；同时，ΑΒΑ在植物应对外界各种逆境胁迫过程中也起着重要作用，例 如干旱、冷、高盐等非生物胁迫W及病虫害等生物胁迫。植物ΑΒΑ信号转导通路分子机制的 阐明对调控植物生长、改良遗传特性、提高作物品质、促进现代农业生产发展具有重要的意 义。
[0003] 近30年来，植物中有关ΑΒΑ信号转导方面的研究取得了很多重大进展，包括ΑΒΑ受 体在内的大量ΑΒΑ信号转导功能组分相继被鉴定，例如蛋白激酶、蛋白憐酸酶、Ε3连接酶、伴 侣蛋白、各种类型的转录因子等等，运些发现有力推动了植物中ΑΒΑ信号转导调控机理的阐 明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了Ξ种不同的ΑΒΑ受体受体：儀馨合酶Η亚基畑LH/ ABAR、G蛋白偶联受体(GTGUGTG2)及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体。ABAR是第一个被 鉴定出来的植物ΑΒΑ受体;后续的研究表明，ABAR介导的ΑΒΑ信号通路是非常复杂的，转录因 子WRKY18/40/60及分子伴侣蛋白CPN20参与到ABAR介导的ΑΒΑ信号通路之中。
[0004] SUMO化/类泛素化修饰是一序列酶介导的生化级联反应过程，通过运个酶促反应 能够将SUMO蛋白共价的连接到相应的祀蛋白上，运些祀蛋白包括病毒蛋白和细胞蛋白等 等。SUMO化修饰最早发现于1996年，在酵母细胞中鉴定到一种类似泛素的蛋白，并且该蛋白 能共价结合到另一个蛋白的赖氨酸残基上。类泛素化修饰的整个过程包括了多步酶促反 应，参与反应的酶有:异源二聚的活化酶SAE1/2,结合酶化c9，SUM0连接酶。类泛素化和泛素 化在生物学功能方面有着很大的差异。泛素化主要是将把蛋白贴上泛素标签，然后通过蛋 白酶体将祀蛋白降解;而类泛素化修饰的蛋白并不被蛋白酶体识别。有研究报道，SUMO通过 与泛素竞争赖氨酸活性位点从而阻断降解过程；另外，经过SUMO修饰的蛋白能够被特异的 SUMO依赖性泛素化酶识别来促进泛素化修饰。类泛素化除了影响蛋白质的稳定性外，SUMO 还能够通过对转录因子修饰或者直接修饰DNA分子来进行转录调节。另外，类泛素化修饰在 RNA加工、病毒复制、免疫反应、基因组保留、染色质重组、核质运输等方面也起着重要的作 用。
[0005] SUMO化修饰是一个可逆的过程，去类泛素化是指从祀蛋白上除去洲M0的过程。去 类泛素化是由SENP异肤酶成员催化完成的；另外，SENPs参与SUMO的成熟过程;SENP家族由6 个成员组成：SENP1-3和SENP5-7,在哺乳动物细胞内各个成员具有不同的亚细胞定位： SENP1定位于PML核小体;SENP6定位于细胞质；SENP3定位于核仁;SENP2定位于核孔复合体； 0TS2(0VERLY TOLERANT TO SALT2)是植物中重要的去类泛素化酶，在拟南芥tair网站上的 基因号为Atlgl057(Kht1:ps:// www.arabidopsis.org/)，该基因在响应干旱胁迫及盐胁迫 过程中起着重要的作用。
[0006] 随着ΑΒΑ信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变 植物对ΑΒΑ信号的响应水平，控制植物种子的萌发及植物生长W达到所需要的状态W及利 用天然植物激素实现选择性除草等成为研究前沿。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种0TS2蛋白及其编码基因在调控植物对ΑΒΑ耐受性中的应 用。
[0008] 本发明所提供的应用，具体为如下A或Β:
[0009] A:由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(0TS2蛋白）在如下al)或曰2) 中的应用：
[0010] al)调控植物对ΑΒΑ耐受性；
[OOW 曰2)选育对ΑΒΑ耐受性提高或降低的植物品种。
[0012] Β:由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(0TS2蛋白）的编码基因在如 下al)或曰2)中的应用：
[001引 al)调控植物对ΑΒΑ耐受性；
[0014] a2)选育对ΑΒΑ耐受性提高或降低的植物品种。
[0015] 在本发明中，W上al)中的所述调控植物对ΑΒΑ耐受性均体现为:0TS2蛋白的表达 量越低，则所述植物对ΑΒΑ的耐受性越强;0TS2蛋白的表达量越高，则所述植物对ΑΒΑ的耐受 性越弱。
[0016] 在本发明中，W上所有a2)中的所述选育对ΑΒΑ耐受性提高的植物品种的方法，具 体可包括将所述0TS2蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤;所述选育对ΑΒΑ耐 受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述0TS2蛋白表达量较高的植株作为亲本进行 杂交的步骤。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0018] 本发明所提供的培育转基因植物的方法具体可为如下(Α)或(Β):
[0019] (Α)培育对ΑΒΑ耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤:在受体植物中对 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因 植物;所述转基因植物与所述受体植物相比对ΑΒΑ的耐受性提高。
[0020] (Β)培育对ΑΒΑ耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导 入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物;所述转 基因植物与所述受体植物相比对ΑΒΑ的耐受性降低。
[0021] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的 编码基因（即0TS2基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0022] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第46至1761位核巧酸所示的DNA分子；
[0023] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0024] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0025] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DM分子；
[0026] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90% W上同源性且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0027] 上述严格条件可为用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[00%]其中，序列1由3684个核巧酸组成，为所述0TS2基因在拟南芥基因组中序列，其中 第 382-735位、第 785-863位、第977-1050位、第 1353-1481 位、第 1531-1609位、第 1696-1783 位、第 1814-1891 位、第 1997-2080 位、第 2184-2461 位、第 2560-2774位、第 2898-3016 位、第 3129-3213位、第3322-3407位均为内含子序列；序列2由1936个核巧酸组成，为所述0TS2基 因的cDNA序列，其中第46-1761位为编码序列(0RF);序列1和序列2均编码序列表中序列3所 示的蛋白质，序列3由571个氨基酸残基组成。
[0029] 本发明的再一个目的是提供一种提高植物种子萌发速率的方法。
[0030] 本发明所提供的提高植物种子萌发速率的方法，具体可包括如下步骤：
[0031] (1)在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因进行抑制表达，得到转基因植物;所述转基因植物与所述受体植物相比对ΑΒΑ的耐受性提 局；
[0032] (2)将所述转基因植物的种子播种于含有ΑΒΑ的基质中；在所述含有ΑΒΑ的基质中， 所述转基因植物的种子萌发速率高于所述受体植物。
[0033] 在步骤(2)中，所述ΑΒΑ在所述基质中的含量为0.2-3μΜ(如0.6-3μΜ)。所述基质具 体可为培养基(如MS培养基)或±壤。
[0034] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0035] 进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物 为具体为拟南芥野生型(Col-0生态型）。
[0036] 本发明的又一个目的是提供一种对所述(A)中的所述转基因植物进行除草的方 法。
[0037] 在本发明所提供的对所述(A)中的所述转基因植物（即所述对ΑΒΑ耐受性提高的转 基因植物)进行除草的方法中，所用除草剂是浓度为Μ的ΑΒΑ溶液;所述浓度为Μ的ΑΒΑ溶液对 于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。
[0038] 在上述方法中，所述"所述浓度为Μ的ΑΒΑ溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于 所述转基因植物来说能耐受"是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为Μ的ΑΒΑ溶液后，所述待 除杂草死亡;但向所述转基因植物喷洒所述浓度为Μ的ΑΒΑ溶液后，所述转基因植物不死亡， 且生长状态与喷洒所述浓度为Μ的ΑΒΑ溶液前相比无统计学差异。
[0039] 本发明研究发现0TS2蛋白是ΑΒΑ信号传导的核屯、正调节子。本发明可应用于将植 物激素 ΑΒΑ作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ΑΒΑ的敏感性，利用0TS2调节植 物对ΑΒΑ的耐受性，可通过基因工程手段获得0TS2低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择 性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ΑΒΑ的分子机制、改良遗传特 性，开拓绿色环保、无公害的除草方法等方面具有重要的实用价值和市场前景。
【附图说明】
[0040]图1为0TS2基因 T-DNA插入突变体0ts2-l的鉴定;通过查询拟南芥公开数据库化ir 网站化ttps ://www.arabidopsis .〇巧/)，T-DNA插入在0TS2基因的第11个外显子处。
[0041 ]图2为用实时巧光定量PCR检测0ts2-l突变体中0TS2基因表达量的分析结果。从图 中可W看出，〇ts2-l为基因敲除突变体。
[0042] 图3为ΑΒΑ对ots2-l突变体幼苗生长的影响分析结果。
[0043] 图4为ΑΒΑ对ots2-l突变体种子萌发的影响分析结果。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。W下实施例中的定量试 验，均设置Ξ次重复试验，结果取平均值。
[0047] 拟南芥野生型（Col-