可实现农杆菌共转化的双t-dna载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，设及一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载 体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 当今中国，粮食供需矛盾日益突出。基因工程技术作为现今改良农作物品种，提高 农作物的产量和品质最直接有效的技术手段具有越来越重要的现实意义。
[0003] 转基因技术兴起于二十世纪八十年代，目前该技术已成为作物高产、优质、高抗、 广适育种最直接有效的技术手段。该技术已成功应用于包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花 弁、药用植物、果树W及牧草等的改良。数据报告指出，2014年全球转基因作物种植面积为 创纪录的1.815亿公顷，比2013年增加了600万公顷。中国转基因作物种植面积为390万公 顷，位于世界第六位。可见转基因技术已成为近代农业史上发展利用最快的新技术。但是， 在该技术迅猛发展与高效利用的背后，人们关注的焦点也由转基因植物带来的经济和社会 效益转向转基因植物的安全问题。抗生素抗性和除草剂抗性的选择标记基因的使用导致临 床用抗生素失效;抗除草剂基因流入大自然创造出超级杂草;该类基因及其表达产物危害 动物和人类健康等问题引发热议。因此，如何高效快捷的避免常规转基因植物标记基因在 转基因植物中留存成为现今植物转基因技术的重要目标和迫切任务。
[0004] 目前，针对W上问题研究者对该技术进行了改进:后期对选择标记基因实行敲除； 使用无争议的生物安全基因作为标记基因；不使用选择标记基因。Ξ种方案中使用无争议 的生物安全基因作为标记基因克服了不使用标记基因导致的工作量大的问题，成为主流技 术手段。而在后期实施选择标记基因敲除则可W在避免选择标记基因所带来的安全隐患的 同时提高多基因转化的成功率。因此，利用生物学手段将已获得的转基因植株中的选择标 记基因敲除和使用无争议的生物安全基因作为标记基因成为当前转基因研究的主要手段。
[0005] 植物转基因体系要求报告基因是一种表达产物非常容易被鉴定的基因。GUS基因 和绿色巧光蛋白（GFP)基因是目前最常用的两种报告基因，二者虽然在作用机理和检测手 段上完全不同，但是作为报告基因二者共同点就是检测方便快捷。GUS基因（β-D-葡萄糖巧 酸酶基因），作为常用报告基因之一，其作用机理是在植物体内表达产生0-葡萄糖巧酸酶从 而催化裂解一系列的β-葡萄糖巧酸，将5-漠-4氯-3-吗隙-β-葡萄糖巧酸脂(X-Gluc)分解为 蓝色物质。因此，通过含有X-Gluc的染液对植物组织染色就可直观的判断植物组织中GUS基 因存在与否。绿色巧光蛋白（GFP)基因作为另一种常用的报告基因是海洋生物中分离得到 的一种控制生物体内生物发光蛋白合成的基因，外界对该类生物发光蛋白施与紫外或蓝光 时，GFP会发出绿色巧光。对GFP进行检测时激发光源是唯一需要的条件，通过激发光源照射 活体材料就可W直观的判断材料中GFP的表达情况。此外GFP基因无论在原核生物还是真核 生物中都能表达出对细胞没有毒害作用且不影响细胞正常生长的蛋白质。
[0006] 报告基因的使用是为了迅速准确的检测到转基因阳性组织或个体，在转基因过程 中还有另外一个不容忽视的问题，任何转基因技术手段得到的转化细胞与非转化细胞相比 都只占少数，两者存在竞争，而作为异种细胞的转化细胞的竞争力很弱。因此，必须对转化 细胞进行筛选。在有选择压力的条件下，利用抗性基因在转化体内的表达，有利于从大量的 非转化细胞中选择出转化克隆。此类基因即为选择标记基因，该类基因的使用大大减少后 期工作量，目前使用的选择标记基因主要是抗潮霉素基因、抗除草剂基因等。
[0007] 目前，在众多转基因植株选择标记基因剔除的方法中，共转化法备受关注，该方法 具有简便高效的特性，已被广泛应用于粮食作物、油料作物W及经济作物的转基因植株选 择标记基因的剔除。众所周知，将选择标记基因和待转化的目标基因分别构建到两个独立 的载体上，通过将两个载体同时转化植物受体，得到转基因共整合体To代，在Τι代生殖生长 阶段通过配子体重组得到只含目的基因的转基因阳性植株Τ2代，即为共转化法。在对共转 化法深入研究的过程中，研究人员逐渐认识到该方法存在弊端，首先不同的受体组织对选 择标记基因和目的基因的整合效率有差异，To代中只含有目的基因的个体将被淘汰，而只 含有选择标记基因的个体则会被错误的留存;再者选择标记基因和目的基因在转化过程中 容易整合到受体植物基因组的同一个位点，最终在后代中难W达到分离的目的。在之后的 研究中通过将选择标记基因和目的基因插入到同一质粒中相互独立的T-DNA区内构成的含 有两个T-DNA区的超级双元载体大幅度提高了选择标记基因和目的基因的共整合效率，但 是大部分的选择标记基因和目的基因都整合到了基因组的同一位点使得在Τι代生殖生长 过程中，双T-DNA载体上的基因不能分离，无法获得只含有目的基因的转基因阳性植株。建 立简便快速的，剔除选择标记基因得到仅含有目的基因的安全转基因植株的方法，是目前 植物转基因工作的重点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体。
[0009] 本发明的另一目的是提供上述双T-DNA载体的构建方法及应用。
[0010] 为了实现本发明目的，本发明的一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其是将 报告基因 GUS和抗性筛选标记基因串联，将巧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联 序列分别连入两个独立的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体(例如PCAMBIA1302)上构建 得到的。
[0011] 所述抗性筛选标记基因包括抗生素抗性基因和抗除草剂基因；所述抗生素抗性基 因包括潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因；所述巧光报告基因包括 们的增强型基因等。
[0012] 本发明的可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体其核巧酸序列如SEQ ID NO: 25所 /J、- 〇
[0013] 本发明还提供所述双T-DNA载体的构建方法，包括W下步骤：
[0014] 1)载体A的构建：WpCAMBIA1302载体为骨架，设计引物分别通过PCR扩增得到终止 子N0S和T-DNA左边界LB，N0S引入酶切位点Bstell和BamHI，LB引入酶切位点BglII和SphI， 其中BamHI和Bglll是同尾酶;将扩增得到的NOS和LB分别连到PMD19-T载体上，用酶Bstell 和BamHI将NOS片段切下，用酶Bgl II和SphI将LB切下，将得到的酶切两个片段与载体 PCAMBIA1302经Bstell和SphI酶切后回收的大片段，用T4连接酶进行Ξ片段连接，得到含有 两个LB边界的载体A;
[001引2)载体B的构建:设计同源重组特异引物，通过PCR扩增得到两个独立UBI启动子片 段，用酶BamH巧日Spel对载体A进行酶切，回收大片段，与上述扩增得到的两个独立UBI启动 子片段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的UBI启动子，且两个背对的UBI 之间含有Sal I酶切位点的载体B;
[0016] 3)载体C的构建：WpCAMBIA1302载体为骨架，设计引物通过PCR扩增得到两个独立 右边界RB，对载体B进行Sail单酶切，与上述扩增得到的两个独立RB片段采用同源重组的方 法进行连接，得到含有两个背对的RB的载体C;
[0017] 4)双T-DNA载体的构建:设计同源重组特异引物扩增GUS156基因片段和Nos poly-A，分别回收PCR产物，对载体C进行ΚρηΙ单酶切，利用多片段同源重组将酶切后的载体C与扩 增得到GUS156基因片段和Nos poly-A连接，构建得到双T-DNA载体。
[0018] 其中，步骤1)扩增终止子N0S的引物序列如SEQ ID N0:1和2所示，扩增T-DNA左边 界LB的引物序列如SEQ ID NO:3和4所示;扩增得到的终止子N0S和T-DNA左边界LB序列分别 如沈Q ID NO:5和6所示。
[0019] 步骤2)扩增两个独立UBI启动子片段的引物序列分别如SEQ ID N0:7-10所示;扩 增得到的两个独立UBI启动子片段分别如SEQ ID NO: 11和12所示。
[0020] 步骤3)扩增两个独立右边界RB的引物序列分别如SEQ ID N0:13-16所示;扩增得 到的两个独立右边界RB序列分别如SEQ ID NO: 17和18所示。
[0021] 步骤4)扩增Nos poly-A的引物序列分别如SEQ ID NO: 19和20所示，扩增GUS156基 因片段的引物序列分别如SEQ ID N0:21和22所示;扩增得到的Nos poly-A和GUS156基因片 段序列分别如SEQ ID NO:23和24所示。
[0022] 本发明进一步提供所述双T-DNA载体在制备无选择标记的转基因植物中的应用。
[0023] 通过叶盘法转化烟草，通过对再生植株叶片进行GUS染色和GFP检测，筛选得到既 能被X-GLUC染液染成蓝色，又能在紫外或蓝光激发下观察到绿色巧光蛋白的阳性转基因植 株。
[0024] 本发明针对如何快速的剔除选择标记基因得到只含有目的基因的安全转基因植 株的方法的问题，结合生物安全标记基因的利用W及剔除转基因植株选择标记基因运两个 研究热点，对传统的双T-DNA载体进行了改进。在载体构建过程中，为了有效提高基因整合 的效率W及安全转基因植株的产生，将报告基因 GUS基因和筛选基因抗潮霉素基因串联，将 GFP基因和目的基因串联（串联过程保证四个基因均具有本身完整的表达框），分别连入两 个独立的T-DNA区，运样就构建得到含有双报告基因的双T-DNA载体，后续通过检测两个报 告基因，就能快速筛选得到含有目的基因和生物安全标记GFP的转基因安全植株。
[0025] 本发明具有W下优点：
[00