一种β-甘露聚糖酶活性的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种酶活检测方法，具体设及一种β-甘露聚糖酶活性的测定方法。
【背景技术】
[0002] β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan,mannanohy化olase ,EC. 3.2.1.78)，简称 0-〇-甘露聚糖酶或0-甘露聚糖酶（0-〇-111日]1]1日]1日3日，0-1]1日]1]1日]1日3日），是一类能够水解含有0-1，4-D-甘露糖巧键的甘露糖(其中包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等）的水解内 切酶，属于半纤维素酶类，可广泛地用于工业、农牧业生产的多个领域，关于该酶的研究与 开发近年来一直受到许多科研工作者的普遍重视。β-甘露聚糖酶可W将多糖降解为低聚 糖，因生产原料和β-甘露聚糖酶来源的不同，甘露聚糖的水解产物、功能、性质及应用环境 也不尽相同。因此有效测定0-甘露聚糖酶活性是生产高活性酶的有效途径，而传统方法对 β-甘露聚糖酶的测定易受到发酵液中残留培养基的影响，其结果严重偏离真实值。本发明 WAkino方法为基础，研制出一种有效的测定地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)发 酵过程中β-甘露聚糖酶的活性大小。该方法的建立可W大大的减小发酵液中底物对酶活性 测定的干扰，使得测定准确性高，结果真实可靠，为研究发酵过程中有效的测定β-甘露聚糖 酶活性提供实践指导。
【发明内容】
[0003] 本发明设及一种β-甘露聚糖酶活性的测定方法，其包括如下步骤：
[0004] (1) W缓冲液A和魔芋粉制备底物溶液；
[000引（2)将粗酶液加入底物溶液中，在适宜溫度下反应；
[0006] (3)将粗酶液W与步骤(2)相同的比例加入缓冲液A中，在与步骤(2)相同的适宜溫 度下反应相同时间；
[0007] (4)在比色管中分别加入步骤(2)和步骤(3)的所得溶液W及DNS试剂，沸水浴显色 后定容;步骤(2)所得溶液W底物溶液作为空白，步骤(3)所得溶液W缓冲液A作为空白，W 检测0D550nm值；
[0008] (5)步骤(2)所得溶液0D550nm值减去步骤(3)所得溶液0D550nm值在标准曲线中查 找对应生成甘露糖的量，并通过下式计算β-甘露聚糖酶活力：
[0009]
[0010]进一步地，所述缓冲盐A为pH值= 4.0的Na2HP〇4-巧樣酸缓冲液或CH3C00H-C也COONa溶液。
[0011] 进一步地，步骤（1)中所述底物溶液的魔芋粉浓度为〇.1%-1.〇%(*八），优选为 0.3%-〇. 7% (w/v)，更优选为0.5% (w/v)。
[0012] 进一步地，步骤(2)中粗酶液与底物溶液的配比W及步骤(3)中粗酶液与缓冲液A 的配比为1:5-10(v/v)，优选为1:9(v/v)。
[0013] 进一步地，步骤(2)和步骤(3)的反应溫度为50-60°C，优选为55°C;反应时间为20-40min，优选为 30min。
[0014] 进一步地，还包括绘制甘露糖标准曲线的步骤。
[0015] 本发明在原有酶活测定方法的基础上研制出针对B. licheniformis皿化JT-01利 用魔芋粉产β-甘露聚糖酶的酶活检测方法，解决由于发酵液中残留的魔芋粉和底物溶液中 未被消耗的魔芋粉使得酶活力结果较真实值偏高的问题，真实客观的测定β-甘露聚糖酶成 为可能。该方法的建立为不同底物所导致酶活性测定不准确性的研究提供理论参考，为工 业化生产高活性的β-甘露聚糖酶提供实践指导。
[0016] 本发明WAkino方法为基础，加入两个对照组，W此消除试验过程中发酵液中残留 的魔芋粉造成的影响和底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。当W空白缓冲液做对照 时，所得的酶活力变化趋势与实验组基本相同，均呈现了先缓慢上升，而后下降的趋势。而 W水为对照时，波动较大，酶活变化趋势有时与实验组变化趋势并不完全吻合，此时此方法 并不能排除发酵液中魔芋粉的影响。可见，W空白缓冲液作为对照时，可W更准确的描述酶 活力变化趋势。
【附图说明】
[0017] 图1为当W水和缓冲液做对照时酶活力变化趋势。
【具体实施方式】
[001引实施例1、地衣芽抱杆菌种子液的制备
[0019] 在无菌条件下挑取适量斜面保藏菌株B.licheniformis皿化JT-01于皿化JT-01 (该菌株已在之前专利CN102191235A中公开，保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号 CCTCC M209288) 20mL/50mL LB液体培养基中，37°C、160r/min振荡 1 Oh;再 W1 % (v/v)接种 量转接入100mL/500mL发酵种子培养基中（魔芋粉lOg，蛋白腺30g，K2HP〇4 · 3H20 5g， MgS化· 7此0 0.2g，蒸馈水溶解并补足至IL，调抑值至8.0，121°C高压湿热灭菌15min)，37 °C、16化/min振荡1化获得种子液。 巧020]实施例2、地衣芽抱杆菌扩大发酵培养方式
[0021]本实施例分别在摇瓶水平及化发酵罐两种方式下进行培养，所W在进行摇瓶发酵 培养时，是将种子液W6.7 % (v/v)的接种量，接入100mL/250mL的Ξ角瓶，培养溫度37°C、 16化/min，发酵48h结束;在发酵罐扩大培养时，是W6.7 % (v/v)的接种量，在火焰的保护下 接入化发酵罐中进行发酵培养，培养溫度37°C、揽拌速率30化/min、通气量化/min,发酵4她 结束。产酶培养基为:魔芋粉60g(灭菌完毕后加入发酵罐），蛋白腺30g，K2HP化· 3此0 5邑， MgS〇4 · 7出0 0.2g，蒸馈水溶解并补足至化，调pH值至8.0，12rC高压湿热灭菌20min。 巧022] 实施例3、粗酶液样品的制备
[0023]取适量发酵液样品（包括摇瓶水平及发酵罐水平），4500r/min、4°C冷冻离屯、 20min，取上清即为粗酶液。 巧024]实施例4、绘制甘露糖标准曲线
[0025] a.依照表1所示设计配制甘露糖梯度溶液，每25mL比色管中加入3.0mL DNS试剂， 煮沸显色5min后，加蒸馈水定容至25mL，充分混匀。W0号比色管为空白测定ODsso?。
[0026] 表1甘露糖梯度溶液设计
[0027]
[0028] b. W甘露糖含量(mg)为横坐标X，WODsso?为纵坐标Y，绘制标准曲线。
[0029] 实施例5、测定0-甘露聚糖酶活力
[0030] WAkino方法为基础，略作修改测定酶活力。WpH值=4.0的化抽P化-巧樣酸缓冲液 配制魔芋粉底物溶液，浓度0.5 % (w/v)。将0.1 mL粗酶液加入0.9mL底物溶液中，置于55°C水 浴锅精确计时反应30min。之后于每支比色管中加入DNS试剂3mL，沸水浴显色5min，冷却后 定容至25mL，W底物溶液作为空白对照，测定ODssonm。一个酶活力单位化)定义为:在上述反 应条件下，每分钟产生相当于1皿〇1 D-甘露糖的酶量。
[0031] 上述方法测定的酶活力结果较真实值偏高，运是由发酵液中残留的魔芋粉和底物 溶液中未被消耗的魔芋粉造成的，因此在上述试验基础上，加入两个对照组1和2。对照组1 是将O.lmL粗酶液加入0.9mL水中，同溫度同时间水浴、沸水浴处理样品，并W水为空白对 照，W此消除实验过程中发酵液中残留的魔芋粉造成的影响;对照组2是将O.lmL粗酶液加 入0.9mL缓冲液中，同溫度同时间水浴、沸水浴处理样品，并W缓冲液为空白对照，W此消除 实验过程中底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。
[0032] 根据实验组减去对照组0D日日日nm值在标准曲线中查找对应生成的甘露糖量，并通过 下式计算β-甘露聚糖酶活力：
[0033]
[0034] 公式中30min代表水浴30min，0.18代表一甘露聚糖相对分子质量的180，为了使计 算结果的单位保持一致，所W把180缩小了 1000倍。
[0035] Akino法测定酶活力较酶活力真实值偏高，根据大量文献查阅和反复试验、分析， 运可能是由于发酵液中残留的魔芋粉和底物溶液中未被消耗的魔芋粉造成的，因此加入水 对照组和缓冲液对照组，W此消除实验过程中底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。
[0036] 由图1可W看出，实验组酶活力值随着发酵时间增长而上升，到24h左右达到最大 1342.89 ±57.24U/mL，然后逐渐降低至4化最低，最低酶活力为221.79U/mL。实验同时设定 两个对照，水对照组和空白缓冲液液对照组，当W空白缓冲液做对照时，所得的酶活力变化 趋势与实验组基本相同，均呈现了前期缓慢上升，24h达最高酶活，而后下降的趋势;而W水 为对照时，波动较大，酶活变化趋势有时与实验组变化趋势并不完全吻合，如图1中化水对 照组酶活力为289.68 ± 7.31U/mL，与实验组化酶活力297.45 ± 9.24U/mL几乎无差异；1化实 验组酶活力为858.75 ± 12.97U/mL较12h的酶活力786.15 ± 11.23U/mL上升幅度不是很大， 缓冲液对照组16h酶活力为335.50 ± 9.12U/mL较1化酶活力312.05 ± 6.24U/mL上升幅度不 大，运与实验组酶活力变化趋势相似，而水对照组16h酶活力445.93 ± 8.32U/mL和302.83 ± 7.94U/mL呈现了大幅度的升高，此时此方法并不能排除发酵液中魔芋粉的影响。可见，W空 白缓冲液作为对照时，可W更准确的描述酶活力变化趋势。
【主权项】
1. 一种e-甘露聚糖酶活性的测定方法，其包括如下步骤： (1) W缓冲液A和魔芋粉制备底物溶液； (2) 将0-甘露聚糖酶粗酶液加入底物溶液中，并进行反应； (3) 将0-甘露聚糖酶粗酶液W与步骤(2)相同的比例加入缓冲液A中，在与步骤(2)相同 的溫度下反应相同时间； (4) 在比色管中分别加入步骤(2)和步骤(3)的所得溶液W及DNS试剂，沸水浴显色后定 容;步骤(2)所得溶液W底物溶液作为空白，步骤(3)所得溶液W缓冲液A作为空白，W检测 ODs加皿f直； (5 )步骤(2 )所得溶液ODssonm值减去步骤(3 )所得溶液ODssonm值在标准曲线中查找对应生 成甘露糖的量，并通过下式计算e-甘露聚糖酶活力：2. 根据权利要求1所述的0-甘露聚糖酶活性的测定方法，其特征在于，所述缓冲盐A为 pH值=4.0的Na2HP〇4-巧樣酸缓冲液或C出COOH-C出COONa溶液。3. 根据权利要求1-2任一项所述的0-甘露聚糖酶活性的测定方法，其特征在于，步骤 (1) 中所述底物溶液的魔芋粉浓度为0.1 %-1.0 % (w/v)，优选为0.3 %-0.7 % (w/v)，更优选 为 0.5%(w/v)。4. 根据权利要求1-3任一项所述的(6-甘露聚糖酶活性的测定方法，其特征在于，步骤 (2) 中0-甘露聚糖酶粗酶液与底物溶液的配比W及步骤(3)中0-甘露聚糖酶粗酶液与缓冲 液A的配比为1:5-10(v/v)，优选为1:9(v/v)。5. 根据权利要求1-4任一项所述的0-甘露聚糖酶活性的测定方法，其特征在于，步骤 (2)和步骤(3)的反应溫度为50-60°C，优选为55°C;反应时间为20-40min，优选为30min。6. 根据权利要求1-5任一项所述的0-甘露聚糖酶活性的测定方法，其特征在于，还包括 绘制甘露糖标准曲线的步骤。
【专利摘要】本发明涉及一种β-甘露聚糖酶活性的测定方法，其包括如下步骤：(1)以缓冲液A和魔芋粉制备底物溶液；(2)将粗酶液加入底物溶液中，在适宜温度下反应；(3)将粗酶液以与步骤(2)相同的比例加入缓冲液A中，在与步骤(2)相同的适宜温度下反应相同时间；(4)在比色管中分别加入步骤(2)和步骤(3)的所得溶液以及DNS试剂，沸水浴显色后定容；步骤(2)所得溶液以底物溶液作为空白，步骤(3)所得溶液以缓冲液A作为空白，以检测OD550nm值；(5)步骤(2)所得溶液OD550nm值减去步骤(3)所得溶液OD550nm值在标准曲线中查找对应生成甘露糖的量，并通过公式计算β-甘露聚糖酶活力。
【IPC分类】C12Q1/34
【公开号】CN105506059
【申请号】CN201610031762
【发明人】葛菁萍, 平文祥, 赵丹, 杜仁鹏, 金曼
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月18日