强直性脊柱炎易感性检测的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，特别是涉及一种利用 基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏（VonBechterev)病或马-施二氏 (Maritstrumpell)病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响 骨盆的紙骼关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、 X线显示两侧紙骼关节炎（sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯紙骼关节，并重 点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis, AS)。
[0003] 强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人发病 率最高，北美印第安人发病率为2. 7%~6. 3%。其次为白种人，白种人中发病率为0. 1%~ 1.4%。黄种人低于白种人，我国约为0.3%。而黑人发病率最低，约为白人的1/4,在非洲 仅为0. 2%。
[0004] 强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是20~30岁的青年男性。
[0005] 强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传，有明显的家族遗传倾向，遗传因素>90%。 据调查，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为82. 90% W 上的AS病人具有HLA-B27阳性，在正常人群中阳性率为8%;子女HLA-B27阳性占50%，发 生强直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定论，HLA-B27作为独立的致病基因在AS的发 病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有1 %~5%发展成为AS，提示还有其他基因参 与AS的发病。
[0006] PSMB7基因编码的产物属于蛋白酶体B型家族，是一种泛素-蛋白酶复合物中的 20S核必目-亚单位。蛋白酶体是一种存在于胞质和胞核内的蛋白水解酶复合物，负责降解 细胞内大部分蛋白质，在血1C I类分子包括HLA-B27分子的表达及相关抗原呈递过程中起 关键作用。MHCI类分子呈递的抗原均来源于蛋白酶体的降解产物。蛋白酶体的功能受其结 构组成的调控，其核必部分是由α和目亚单位组成的四环状圆柱形结构，与PA28结合后 成为免疫蛋白酶体。PSMB7是目环中重要的结构亚单位。目环的改变会影响到降解蛋白 质的速度及切割位点，W及内源性蛋白质的降解和抗原的呈递。PSMB7基因的多态性影响着 免疫蛋白酶体与待降解目标蛋白的结合情况，引起降解内源性蛋白质产生的抗原肤的数量 和性质发生改变，其中可能包括能诱导AS发生的特异性抗原肤。因而，对于PSMB7基因与 强直性脊柱炎的关系有进一步研究的价值。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种强直性脊柱炎易感性检测的方法及其试剂 盒。本发明通过利用基因型对强直性脊柱炎易感性进行检测，为辅助诊断（尤其是早期诊 断）强直性脊柱炎和治疗强直性脊柱炎提供基础。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种对个体的强直性脊柱炎易感性检测的方法，包 括步骤：
[0009] 检测该个体的PSMB7基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PSMB7基因、转录本和 /或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0010] 在另一优选例中，所述的方法中检测的是PSMB7的基因或转录本，并与正常PSMB7 核巧酸序列比较差异。
[0011] 在另一优选例中，所述的差异是W下的单核巧酸多态性（SNP);
[001引第306位C 一 G ;其中，核巧酸位置编号基于沈Q ID NO. 1。
[0013] 在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在PSMB7基因的单核巧酸多态 性的方法，包括步骤：
[0014] 1)用PSMB7基因特异性引物扩增样品的PSMB7基因，得到扩增产物；
[0015] 2)检测扩增产物中是否存在W下的单核巧酸多态性：
[001引第306位C 一 G ;其中，核巧酸位置编号基于沈Q ID NO. 1。
[0017] 在另一优选例中，所述PSMB7基因特异性引物具有SEQ ID NO. 2和3的序列。
[0018] 在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp，且含有SEQ ID NO. 1中第 306 位。
[0019] 在本发明的第Η方面，提供了一种用于强直性脊柱炎易感性检测（利用基因型检 测强直性脊柱炎）的试剂盒，其包括：特异性扩增PSMB7基因或转录本的引物，更佳地，所述 的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第306位的扩增产物。
[0020] 在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：
[002。 1)与SEQ ID NO. 1中第306位的突变结合的探针；
[002引 2)识别SEQ ID NO. 1中第306位的突变限制性内切酶。
[0023] 在另一优选例中，所述的突变选自W下的单核巧酸多态性：
[0024] 第306位C 一 G ;其中，核巧酸位置编号基于SEQ ID NO. 1。
[002引所述引物的序列，可如沈Q ID NO. 2和3所示。
[0026] 所述扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第306位。
[0027] 所述试剂盒还包括；Taq酶、dNTPs、镇离子、常规的PCR反应缓冲液。
[0028] 本发明经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。发现 和证明了 PSMB7的基因组序列与强直性脊柱炎密切相关，其中关联研究结果显示，在PSMB7 基因的SEQ ID NO. 1中第306位的SNP (第306位C 一 G)(记为rs2236386)在对照组和病 例组中的分布存在显著性差异（P < 0. 05)，因此，可作为辅助性检测强直性脊柱炎（或其易 感性）的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
[0029] 本发明对PSMB7基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分 SNP与强直性脊柱炎易感性并不相关，然而关联研究表明SEQ ID NO. 1中第306位C 一 G却 是与强直性脊柱炎易感性关联性非常高的SNP。
[0030] 具体而言，本发明掲示了 PSMB7基因一种单核巧酸多态性（SNP) W及该多态性与 强直性脊柱炎的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO. 1所示序列的第306位的G/C多态， 基因型CC在强直性脊柱炎病人群中的频率，要高于在正常对照人群中的频率。
[0031] 基于本发明的新发现，PSMB7蛋白或多肤有多方面的新用途。送些用途包括；用于 辅助性诊断强直性脊柱炎。
[0032] 另一方面，本发明还包括对人PSMB7基因 DNA或是其片段编码的多肤具有特异 性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。送里，"特异性"是指抗体能结合于人 PSMB7基因产物或片段。较佳地，指郝些能与人PSMB7基因产物或片段结合但不识别和结合 于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括郝些能够结合并抑制人PSMB7蛋白的分 子，也包括郝些并不影响人PSMB7蛋白功能的抗体。
[0033] 本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片 段，如F油'或（F油)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗 体。
[0034] 本发明的抗体可W通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化 的人PSMB7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物W诱导多克隆抗体的产 生。与之相似的，表达人PSMB7蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产 抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括弗氏佐剂等。
[0035] 本发明的抗体也可W是单克隆抗体。此类单克隆抗体可W利用杂交瘤技术来制 备。本发明的抗体包括能阻断人PSMB7蛋白功能的抗体W及不影响人PSMB7蛋白功能的抗 体。本发明的各类抗体可W利用人PSMB7基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获 得。送些片段或功能区可W利用重组方法制备或利用多肤合成仪合成。与人PSMB7基因产 物的未修饰形式结合的抗体可W用原核细胞（例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物 而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体（如糖基化或磯酸化的蛋白或多肤），可W用真核细 胞（例如酵母或昆虫细胞）中产生的基因产物来免疫动物而获得。
[0036] 抗人PSMB7蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人PSMB7 蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗PSMB7抗体是不识别正常PSMB7但识别突变 PSMB7的抗体，或者识别正常PSMB7但不识别突变PSMB7的抗体。利用送些抗体，可W方便 地进行蛋白质水平的强直性脊柱炎易感性检测。
[0037] 利用本发明PSMB7蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PSMB7蛋白发生相互 作用的物质，如抑制剂、激动剂或枯抗剂等。
[0038] 本发明还涉及定量和定位检测人PSMB7蛋白水平的诊断试验方法。送些试验是本 领域所熟知的，且包括化ISA等。
[0039] -种检测检测样品中是否存在PSMB7蛋白的方法是利用PSMB7蛋白的特异性抗体 进行检测，它包括：将样品与PSMB7蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成 了抗体复合物就表示样品中存在PSMB7蛋白。
[0040] PSMB7蛋白的多聚核巧酸可用于PSMB7蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面， PSMB7蛋白的多聚核巧酸可用于检测PSMB7蛋白的表达与否或在疾病状态下PSMB7蛋白的 异常表达。如PSMB7基因 DNA序列可用于对活检标本的杂交W判断PSMB7蛋白的表达异 常。杂交技术包括Southern印迹法，Ncxrthern印迹法、原位杂交等。送些技术方法都是公 开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核巧酸的一部分或全部可 作为探针固定在微阵列（microarray)或DNA芯片（又称为"基因芯片"）上，用于分析组 织中基因的差异表达分析和基因诊断。用PSMB7蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应 (RT-PCR)体外扩增也可检测PSMB7蛋白的转录产物。
[00川检测可W针对cDNA，也可针对基因组DNA。PSMB7蛋白突变的形式包括与正常野生 型PSMB7基因 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技 术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋 白的表达，因此用Ncxrthern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
[0042] 最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用PSMB7基因特异性引物扩增样品的 PSMB7基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在W下单核巧酸多态性；第306位 C 一 G，其中，核巧酸位置编号基于沈Q ID NO. 1。
[004引应理解，在本发明掲示了 PSMB7基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之后，本领域 技术人员可W方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方 法确定是否存在第306位C 一 G。通常，引物的长度为15-5化P，较佳地为20-3化P。虽然引 物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不 互补（尤其是引物的5'端）的情况下，也能够特异性地扩增（即仅扩增出所需的片段）。
[0044] 含有送些引物的试剂盒和使用送些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物 扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO. 2和3 的序列。
[0045] 虽然扩增产物的长度没有特别限