一种用于新一代无创产前诊断领域的细胞鉴定方法

文档序号:9745063阅读:636来源:国知局
一种用于新一代无创产前诊断领域的细胞鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产前诊断领域。更具体而言,本发明涉及胎儿细胞的鉴定。
【背景技术】
[0002] 目前所用的产前诊断方法按照取材方法的不同主要分为有创产前诊断和无创产 前诊断。有创产前诊断主要包括绒毛穿刺和羊水穿刺,该类方法可W得到完整的胎儿基因 组,获得准确的诊断结果,成为产前诊断的金标准,但是由于取样过程有创伤,会给孕妇和 胎儿带来潜在的危害。无创诊断方法主要有超声波检查、母体外周血清标志物测定和胎儿 细胞检测等。其中超声波检查因其分辨率及准确性的限制,更多的是与其他检测方法结合 起来使用,主要作为一种初步的筛查方法。直到1997年,卢燈明等发现孕妇血浆中存在胎 儿游离的DNA[1],随后,利用孕妇外周血中游离DNA并结合高通量测序技术检测胎儿染色 体数目异常的研究越来越多巧,3, 4, 5]。该方法具有高灵敏性和高特异性的特点,并且对胎 儿没有任何创伤。因此,基于母体外周血游离DNA的无创产前诊断技术逐渐被医院和孕妇 所接受[6]。
[000引但是利用胎儿游离DNA也有其自身的缺陷,由于孕妇外周血中除了胎儿来源的游 离DNA,还有存在大量母源DNA背景,并且DNA都是W小片断的形式存在,不利于其他遗传 突变的检测比如单基因病。正因为如此,科学家们正在寻找一种无创方法来获得完整的胎 儿基因组。研究表明孕妇外周血中,孕妇宫颈分泌物中都含有胎儿细胞[7,8, 9, 10, 11],胎 儿细胞完全来自胎儿,包含完整的胎儿基因组,覆盖胎儿的所有遗传信息。因此,利用母体 中存在的胎儿细胞进行产前诊断将是目前基于胎儿游离DNA产前诊断的一个延伸和补充。 但由于孕妇外周血中胎儿细胞极度稀少,每毫升全血中胎儿有核红细胞只有约1-2个,大 约在10 5-107个母体细胞中只有一个胎儿细胞[7,引;宫颈分泌物中,胎儿细胞较多,约2000 个母体细胞中含有一个胎儿细胞[10, 11];要获得完整的胎儿基因组就要在母亲背景众多 的细胞中分离出目标胎儿细胞。
[0004] 目前已有很多关于从母体中分离胎儿细胞的技术方法报道,比较常用 的主要有密度梯度离必[12, 13, 14, 15]、流式细胞仪技术和英光激活细胞分选法 (fluorescence-activated cell so;rting, FACS) [16, 17, 18, 19, 20]、磁激活细胞分选法 (ma即etically-activated cell so;rting, MACS) [21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]、显微操作分离 法巧8, 29]、基于微流控技术的分离方法巧0,31]。送些方法都各自存在优缺点,通常会结 合起来使用。通过送些技术手段分离到胎儿细胞,进行全基因组扩增后,获得足够的DNA用 于测序,可检测胎儿的各种遗传变异,包括染色体数目异常,点突变等。该技术结合了有创 产前诊断的准确性一胎儿细胞完全来自胎儿和无创产前诊断的无创性一只需孕妇外 周血,可称为新一代无创产前诊断技术。
[0005] 新一代无创产前诊断中,最重要的是运用各种技术方法分离胎儿细胞,而现行的 所有分离方法都需要借助抗原抗体反应来分辨细胞,受抗原特异性的局限,分离出的目标 细胞有很多的假阳性,不全是胎儿细胞,若是男胎,能用Y染色体上特异的引物PCR进行鉴 定细胞中是否含有Υ特异的基因,同时也无法排除外源污染;若是女胎则无法用Υ鉴定。若 将所有分离得到的细胞进行测序,成本较高,周期较长。送就需要在分离细胞后和上机测序 之前,必须进行细胞鉴定,无论胎儿性别,都可W准确判断哪些是目标胎儿细胞,哪些是母 亲细胞,哪些细胞有外源DNA的污染。

【发明内容】

[0006] 鉴于上述,本发明提供了一种应用于新一代无创产前诊断领域的细胞鉴定方法, 所述方法包括如下步骤:
[0007] (1)提取孕妇及其配偶的样品并提取DNA,对所述DNA进行STR基因分型;
[0008] (2)孕妇血液样品进行密度梯度离必得到细胞悬液,宫颈分泌物样本过细胞筛得 到细胞悬液;
[0009] (3)分选目标细胞并进行全基因扩增,进行高通量测序,并进行STR基因分型;
[0010] (4)根据上述STR基因分型结果,同一 STR基因座下,父母不一样的STR型别,检测 分离得到的细胞基因扩增(例如多重置换扩增)产物是否具有父亲特有STR型别,如有则 认为成功从母体中分离到胎儿细胞。
[0011] 在一个具体实施方案中,本发明方法的STR基因选自8个常染色体上的基因座 D21S11、D7S820、CSF1P0、D13S317、D16S539、D2S1338、D18S51、FGA 和 Υ 染色体上的 16 个 基因座 DYS456、DYS389 I、DYS390、DYS389 II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS393、DYS391、 DYS439、DYS635、DYS392、GATAJM、DYS437、DYS438、DYS448。
[0012] 本发明是细胞鉴定方法在新一代无创产前诊断领域的一次完美结合,在胎儿细胞 分离和测序之间,整合有效的细胞鉴定方法,能更加准确的判断细胞来源,排除污染,提高 测序数据的有效性,进而提高无创产前检测的准确性。
【附图说明】
[001引图1 ;通过微流控分选后,英光显微镜下寻找目标细胞(400讶,我们的目标细胞是 hochest阳性、CD71阳性且CD45阴性的细胞,上排从左往右分别是hochest染色结果、CD71 英光,下排从左往右分别是〔045英光、}10油63*、〔071、〔045重叠效果图。
[0014] 图2 ;分离的细胞进行全基因组扩增产物及父母基因组DNA,8对管家基因进行质 控,粗略评价扩增效果,从左往右分别是标记物、ceU-l、ceU-2、母亲曲NA、父亲曲NA、阳 性对照、空白对照、标记物、由结果可看出cell-1和cell-2都有5条带W上,初步认为全基 因组扩增效果较好。
[0015] 图3 ;细胞MDA产物与父母基因组分别进行STR分型,包括8个常染色体上的基因 座 D21S11、D7S820、CSF1P0、D13S317、D16S539、D2S1338、D18S51、FGA 和 Y 染色体上的 16 个基因座 DYS456、DYS389 I、DYS390、DYS389 II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS393、DYS391、 DYS439、DYS635、DYS392、GATAJM、DYS437、DYS438、DYS448,该图只截取了母亲 8 个 STR 位 点的检测结果。
[0016] 图4 ;STR鉴定后的目标细胞,高通量测序后,得到的数据计算每条染色体的拷贝 率,表中1-24分别指1-22号常染色体及X、Y染色体,纵轴表示拷贝率大小,深色代表样品 ceU-l,浅色代表cell-2,由图看出两个细胞是18- Η体。
【具体实施方式】
[0017] 近年来,大量研究表明,基因分型方法是进行细胞污染鉴定的最有效和准确的方 法。STR(sho;rt tandem r巧eat,串联重复序列)是核必序列为2-6个碱基的短串联重复结 构巧2],人类基因组内STR序列及其丰富,平均每隔邮b-10化就出现一个巧3],绝大多数 STR位于非编码区。约有一半的STR具有遗传多态性。虽然不希望拘園于具体理论,发明 人认为送为个人识别和鉴定提供基础。STR基因分型具有W下优势:一是高度丰富的信息, 可W同时分析多个STR基因座,可W准确的判断污染;二是高度灵敏,可W检测最低0.1 ng DM (约15个二倍体基因组),微量样本即可满足需求,并且可W检测到早期污染;Η是高通 量和系统化平台;采用自动化分析系统可大量检测及数据分析,结果更加准确、客观。除了 STR基因分型外,SNP分型也能达到同样效果,SNP(Single Nucleotide Polymo;rphisms,单 核巧酸多态性)是基因组核巧酸水平上由单个核巧酸变异引起的DM序列的多态性,人类 基因组中每1000个核巧酸就有一个SNP,理论上看每一个SNP位点都可W有Η种不同的变 异形式,SNP分型也可W应用于细胞鉴定。
[0018] 相比已有无创产前诊断技术,新一代无创产前诊断技术具有W下优势,采用高通 量测序分析胎儿细胞,可W -次获得多方面的信息,包括染色体的非整倍体性,染色体的缺 失和插入,还有单个位点的变异等。而细胞鉴定是整个新一代无创产前诊断中最为关键的 步骤,具有W下意义:
[0019] 首先,通过细胞鉴定可判断我们是否具有分离到胎儿细胞,不管男胎女胎,只要有 父母的基因组,都能通过STR分型来鉴定细胞来源,判断分选细胞的成败。
[0020] 其次,通过细胞鉴定可W判断所分选的细胞是否有其他非胎儿细胞的污染,比女口 最常见的丰富的母源细胞背景,也可W排除在全基因组扩增过程可能引入的外源DNA污 染,保证测序数据的可信性。
[0021] 此外,通过细胞鉴定还能降低测序成本,如没有STR分型鉴定,无法排除细胞或 DNA的污染,直接影响数据有效性。
[0022] 本发明涉及到目前常用的胎儿细胞分离,结合第二代测序技术对胎儿染色体的非 整倍性、胎儿染色体的缺失和插入及基因组内的单核巧酸多态性(SN巧进行检测。本发明 的目的是将细胞鉴定整合进送种无创性的产前诊断方法中,W期达到准确判断细胞来源, 排除污染,借此提高无创产前诊断的准确度。
[0023] 该发明虽然在具体实施例中使用的是孕妇外周血样品,也可W是宫颈分泌物样 本,不同样本处理方式不同,最终结果是获得单细胞悬液;该实施例中使用的是微流控等平 台,结合显微切割,但是不局限于送个平台,也可使用流式细胞分选平台,或显微操作等;本 发明实施例中使用的是QIAGEN全基因组扩增试剂盒,扩增原理是多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification, MDA),只要是基于该技术原理的试剂盒都可使用;本发明 实施例中使用的8对管家基因来自人类基因组中非常保守的DNA序列,也可使用其他管 家基因进行初步评价全基因组扩增效果;本发明实施例中细胞鉴定用的是ABI公司的 AmpFLSTR?'MiniFiler? PCR Amplification Kit及3130x1 Genetic Analyzer分析平台, 但在实际应用中并不受到试剂盒和所使用测序平台的限制,比如也可采用质谱SNP分型等 方法;该实施例中使用的是illumia'g·公司的测序仪器设备和原理方法,但在实际应用中并 不受到所使用测序平台的限制,比如可W使用454?公司测序平台或ΑΒΓ s化i
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