快速高效检测基因组dna羟甲基化的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体设及一种快速高效检测基因组DNA径甲基化的方 法。
【背景技术】
[0002] 上世纪70年代，？61111等[1]在哺乳动物DNA中首次发现5-径基胞喀晚(5hmC)的存在， 由于当时技术的限制，对5hmC的进一步验证和研究没有受到重视。2009年，5hmC再一次出现 在科学家的视野，Kriaucionis 口哺Tahiliani 口咕小鼠化rkinje细胞、神经元颗粒和胚胎 干细胞中证实化mC的存在。此后，科学家们陆续在哺乳动物中枢神经、脊髓、肾脏、屯、脏、骨 骼肌、肝脏等组织证实5hmC的普遍存在W。
[0003] 随着高通量测序的出现，对DNA甲基化的检测也随之展开，BS-Seq中亚硫酸盐将胞 喀晚(C)经过横化、脱氨、脱横基转变成尿喀晚化），尿喀晚化)经过PCR扩增被胸腺喀晚(T) 替代，整个过程5mC和化mC不能被转变，通过高通量测序未修饰的胞喀晚(C)与被修饰的胞 喀晚(5mC和5hmC)被区分，但并不能将5mC和5hmC区分开 [5]。
[0004] 随着对5hmC研究的深入，逐渐出现多种基于高通量测序的5hmC检测方法。2011年， Hume等W采用径甲基化抗体特异的识别甲基化DNA片段，发生免疫共沉淀反应，W此富集径 甲基化区域，结合高通量测序对基因组径甲基化进行检测，运种方法被称为hMeDIPD2012 年，化等 [7]利用UDPG保护加 mC，将加 mC转化为SgmCemTet 1蛋白将5mC氧化成5caC，再经亚硫 酸盐进行处理，5gmC不被转化，而5caC被转化为U，通过高通量测序可将加 mC和5mC区分，运 种方法被称为TAB-Seqe2012年，11油361等[8]，通过抓11〇4氧化化111(：为5洗，再经亚硫酸盐进 行处理，5f C转化U，通过高通量测序5hmC被测为T，整个过程5mC不被氧化和转化被测为C，运 种方法被称为oxBS-Seq。
[000引目前，W上Ξ种最为常用的DNA径甲基化检测方法逐渐被应用于科学研究，在应用 过程中它们的优缺点也逐渐显露出来。，
[0006] 基于免疫共沉淀来富集化mC区域的hMeDIP方法，由于径甲基化抗体对径甲基化 DNA片段的识别需要一定数量的化mC，当某一DNA片段中化mC数量少于抗体识别最小数量 时，不能发生免疫共沉淀来富集该DNA片段，后续的高通量测序结果便不能检测出该DNA片 段，hMeDIP仅能检测到DNA中富含径甲基化的区域，不能做到DNA单碱基水平径甲基化的检 测。
[0007] 基于保护5hmC氧化5mC的TAB-Seq方法，建库起始量高（3~扣g)，mTetl蛋白价格昂 贵，亚硫酸盐对DNA存在损伤，需要先对化mC保护效率和5mC氧化效率进行评估再进行高通 量测序，导致建库周期长，并且需要构建BS-Seq文库作为对照，运些因素限制了 TAB-Seq的 广泛应用。
[000引基于氧化化mC的oxBS-Seq方法，建库周期长，商业化氧化试剂价格昂贵，并且存在 氧化试剂和亚硫酸盐对DNA的双重损伤，同时也需要通过Sanger测序评估转化效率，构建 BS-Seq作为对照等，并且测序要求数据量较大。
[0009] 最近，RRHP方法uw作为一种建库周期短、成本化、数据利用率高的鞋甲基化检测 方法，解决了 hMeDIP不能单碱基水平检测、TAB-Seq成本高周期长、oxBS-Seq对DNA损伤大等 问题。该方法的基本原理是使用MspI酶切gDNA，所有含CCGG的序列被酶切;酶切位点两端加 上特殊的巧和P7接头，其中巧接头连接后仍存在MspI酶切位点，P7接头连接后消除掉MspI 酶切位点；使用T4-目GT糖基化5hmC为5gmC，C和5mC不会被糖基化修饰;再次使用MspI酶切 时，5gmC不会被MspI酶切，而C和5mC会被酶切;最后通过琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，PCR 扩增后，对文库进行高通量测序，每测一条reads,即测到一个鞋甲基化位点。该RRHP方法具 有检测精度高、对DNA损伤小等诸多优点，但是该方法的加接头步骤中需要使用包含双脱氧 核糖核骨酸的接头，这造成了检测成本的增加;而且，包含双脱氧核糖核骨酸的接头的合成 往往耗费时间，这造成了检测时间的增加。
[0010] 因而，迫切希望有RRHP方法的快速、化成本的替代方法。
[0011] 参考文献
[0012] 非专利文献
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【发明内容】
[0024] 鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种RRHP方法的快速、 低成本的替代方法及用于该方法的试剂盒。
[0025] 本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：如果在传统R畑P方法的加 接头步骤中使用本发明人设计的特定的P5接头和P7接头(不含双脱氧核糖核巧酸），则能够 快速地、低成本地实现与传统RRHP方法一致的数据品质，从而完成了本发明。
[0026] 良口，本发明包括：
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