具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测领域，具体设及具有较大张力的小环形核巧酸探针，还设及 该探针的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核巧酸的小RNA，其在细胞内具 有多种重要的调节作用。每个miRNA可W有多个祀基因，而几个miRNA也可W调节同一个基 因，其在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可W通过与祀基因的完全互补或不完全 互补来达到祀向切割mRNA或者抑制祀基因的翻译，从而起调苄基因表达的作用；然而运些 祀向mRNA广泛参与一些重要的细胞过程，包括细胞的生长、增殖、分化和调亡，并且在不同 的发育阶段其表达水平也有所不同。因此miRNA被当作许多细胞活力的重调控者。miRNA表 达的改变与许多疾病和失调都有或多或少的关系，但是由于miRNAs高度的序列相似性、种 类的多样性W及序列的短小性，miRNA临床诊断面临了一些挑战。采用传统的方法将miRNA 从组织活细胞中分离出来，然后进行检测，运个过程中由于miRNA在细胞内的浓度是非常低 的，所W必须经过富集和扩增，运会大大耗费时间、精力W及资金;Nor them B101法被认为 是miRNA检测和确认的金标准，但是其特异性和灵敏度均不高，虽然后来一些科学家也对该 方法进行了拓展(比如采用锁核酸LNA修饰的杂交探针、核糖核酸酶保护法），但总的来说运 些方法相对来说需要的样品量较大、步骤繁琐、不适用于高通量分析等限制了其临床应用。 采用RT-qPCR检测miRNA的灵敏度很高，样本量也相对少，但是由于miRNA序列短，要求引物 的序列就更加短小，从而就要求更低的溶解溫度，然而低的溶解溫度会影响PCR扩增。导致 所检测到的是前体的miRNA,而并非是成熟的miRNA,在细胞中前提的miRNA和成熟的miRNA 的水平也不一致，所W该方法也常产生一些假阳性信号，且反应所需要酶和试剂W及检测 的仪器都非常的昂贵，因此也使得成本相应较高。微阵列忍片技术(Microarray)发已被广 泛用于miRNA的检测，相对于其他的检测方法其最大的优点是具有高通量性，然而该技术花 费较大，需要机器加工，一些小型实验室也不具备运些条件;另外，其灵敏度也比较低。W纳 米材料为基础的一些检测方法也越来越多的学者进行了研究，比如纳米金标记技术的检 巧。、基于纳米孔的microRNA传感器、基于量子点的检测W及基于石墨締的检测都为 microRNA的检测提供的方法。分子信标(MB)，是发夹结构的茎环双标记寡核巧酸探针，已被 广泛用于检巧化NA和RNA，具有很高的灵敏度和特异性，但是MB在活细胞中识别miRNA同源序 列的应用仍然鲜有报道。近年来，几种新的miRNA检测方法已被报道，如安培磁力生物传感 器、基于水凝胶的微流体方法W及等速电泳方法。虽然，电化学磁敏传感器等在检测miRNA 有很高的特异性，但病毒蛋白的选择性识别是必要的。基于忍片上修饰水凝胶的方法和等 速电泳法在检测miRNA中被证明是有效的，然而运些技术在检测活细胞中的miRNA的时候是 非常复杂和耗时的。巧光原位杂交(FISH)被认为是活细胞中检测基因表达的最常用的方 法，但是它的识别单碱基错配的miRNAs的能力是有限的。最近，四嗦介导的转移反应和滚环 信号放大的方法已成功地应用于miRNA的检测和成像，然而，运些方法非常繁琐且不容易被 广泛使用。因此，亟待需要一个更简单有效的、高度特异性的、敏感的miRNA的检测和成像的 方法。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供具有较大张力的小环形核巧酸探针;本发 明的目的之二在于提供具有较大张力的小环形核巧酸探针的制备方法;本发明的目的之Ξ 在于提供具有较大张力的小环形核巧酸探针在细胞内生物分子的识别与活性调控方面的 应;本发明的目的之四在于提供具有较大张力的小环形核巧酸探针在制备定性或定量检测 核酸序列的试剂中的应用;本发明的目的之五在于提供含有所述具有较大张力的小环形核 巧酸探针的试剂盒。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 本发明通过设计具有较大张力的小环形核巧酸探针(简称为RP)，由闭合小环形核 巧酸单链（简称为R)与核巧酸长度短于闭合小环形核巧酸单链的核巧酸短单链（简称为 DNAQ)杂交形成;所述小环形核巧酸探针利用闭合小环形核巧酸单链特异识别目标检测物 并与目标检测物杂交同时置换出核巧酸短单链;所述闭合小环形核巧酸单链探针与核巧酸 短单链标记有相互作用性标记系统，该相互作用性标记系统在目标检测物与核巧酸短单链 置换时产生一个或者多个可检测信号，结构如图1所示。由于闭合小环就有较大的环张力， 增加的分子识别的难度，提高了识别的专一性；同时"半竞争性链置换"的使用，进一步提高 了检测的选择性。此外，目标分子诱导的信号由"OFF"变为"ON"，降低了背景信号，提高了信 噪比，并且拓展了其在细胞内的应用。本发明中，检测信号可W为如下方式标记的信号:化 学标记、酶标记、放射性标记、巧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记，优选为巧 光标记;分别于闭合小环形核巧酸单链标记报道分子或巧灭分子，核巧酸短单链标记相互 作用的巧灭分子或报道分子。
[0006] 本发明的探针检测原理：由于R与DNAQ杂交，相互作用性标记系统W巧光标记为 例，巧光报告基团与泽灭基团在巧光能量共转移作用(FRET)下巧光处于"关闭"状态，当目 标检测物添加至反应体系中，目标检测物能够与DNAQ发生置换，然后与R杂交，此时巧光报 告基团与泽灭基团之间的巧光能量共转移作用(FRET)被消除，巧光报告基团释放巧光从而 巧光切换到"开启"状态。但是，如果目标检测物中有一个碱基发生错配时由于来自环形结 的张力将不能完全置换出DNAQ链，从而能够区分完全互补序列与单碱基错配序列，并具有 高的选择性。所W，本发明的RP可用核酸定性或定量检测，并用于区分完全互补核酸序列和 单碱基错配核酸序列，其中核酸可W为DNA、RNA或miRNA。
[0007] 本发明中，闭合小环形核巧酸单链只要能形成环状即可，优选的，所述闭合小环形 核巧酸单链的长度为22~60个碱基。
[0008] 本发明中，具有较大张力的小环形核巧酸探针的制备方法如下:将A信号标记的核 巧酸、肤核酸、锁核酸单链的两端连接形成闭合环状或类似环状结构;然后将所形成闭合环 状或类似环状结构与B信号标记的核巧酸长度短于闭合小环形核巧酸单链的核巧酸短单链 杂交，得小环形核巧酸探针；
[0009] 所述A信号与B信号为相互作用性标记系统。
[0010] 其连接可W采用任意方式连接，优先的通过共价键、疏水相互作用、静电吸引、分 子间引力或生物识别连接。
[0011] 本发明中，利用小环形核巧酸探针具有识别生物分子的能力，因此可W将具有较 大张力的小环形核巧酸探针用于制备识别细胞内生物分子识别与生物活性调控的试剂，用 于细胞内生物分子的识别与活性调控方面的应用，所述生物分子为DNA、RNA、miRNA、蛋白质 或酶中的一种或几种。其中，所述生物分子为DNA、RNA、miRNA或蛋白质。具有较大张力的小 环形核巧酸探针还可W用于定性或定量检测核酸序列，所述核酸序列为DNA、RNA或miRNA序 列。
[0012] 为了使用方便将具有较大张力的小环形核巧酸探针作为试剂制备成试剂盒，检测 时将环形DNA的探针(RP)直接与目标检测物杂交，然后通过电泳分析或巧光检测，通过信号 强度判断目标基因表达量或单碱基错配W及错配位点。
[0013] 本发明的有益效果在于:本发明公开了具有较大张力的小环形核巧酸探针，将探 针设计为环形结构，利用环形结构的较强张力，提高检测特异性和灵敏度，不但能够区分完 全互补和错配一个碱基，还能区分单碱基错配位点，并且使用本发明的环形DNA探针不需要 提取所检测的DNA或RNA，可直接将探针转染进入活细胞中进行成像分析，达到检测效果，其 操作简便，反应条件溫和，室溫即可，还可W用于识别细胞内或细胞外生物分子W及调控细 胞内生物分子表达与活性，应用范围广，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015