柞蚕核型多角体病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种柞蚕核型多角体病毒可视化快速检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测柞蚕核型多角体病毒的引物组、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]柞香胺病是由柞香核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhenrovirus,Αρ-NPV)感染引起的传染蔓延较快的亚急性病害，又称柞蚕核型多角体病，是柞蚕的主要病害之一，对柞蚕生产危害严重，蚕期发病率5%?20%严重制约着蚕业的健康稳定发展。
[0003]目前对柞蚕核型多角体病的诊断主要以病症观察及光学显微镜检查ApNPV为主，光学显微镜检查的灵敏度不高，最低检测量为IXlO6 PIB/mL，且只能在发病后期进行检查。应用PCR的检测方法需要PCR仪、凝胶成象系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间长(约3?4h)，难以达到现场快速检测的目的，不利于实际生产上广泛的推广和使用。因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的检测方法。
[0004]环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是:①恒温扩增:整个扩增反应在恒温条件60?65°C进行，不需要特殊仪器设备;②快速高效:整个扩增和产物检测在Ih内完成;③高特异性:针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高;④高灵敏度:检测极限可低至10个拷贝或更低;⑤鉴定简便:可通过肉眼或浊度计观察反应管内的沉淀变化，或在反应管中加入染色剂后通过肉眼观察颜色变化等方法，对扩增产物进行便捷的检测。
[0005]LAMP法具有特异性强、快速高效、操作简便、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测。目前尚未见应用LAMP技术用于检测柞蚕核型多角体病毒的文献报道和实际应用。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术在柞蚕核型多角体病毒检测技术的不足，提供一种柞蚕核型多角体病毒LAMP可视化快速检测试剂盒。利用所述检测试剂盒，能快速检测出目前法定检验检疫所要求的柞蚕核型多角体病毒。
[0007]本发明的一个目的在于公开一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组。
[0008]本发明的另一个目的在于公开一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒。
[0009]本发明的另一个目的在于公开一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测方法。
[0010]为了实现上述目的，本发明所采用技术方案如下:从基因数据库中检索获得柞蚕核型多角体病毒全基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得柞蚕核型多角体病毒的极高特异性的基因作为靶基因。设计并合成四条特异性LAMP检测用引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1?4;确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法进行验证。[0011 ] 一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组，包括外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP，其核苷酸序列分别为:
外引物ApNPV-F3:CGAGTCACGCGCTTTAGC(SEQ ID NO:1)
外引物ApNPV-B3:TGGCTGTCTAGCTGGTTCT(SEQ ID NO:2)
内引物ApNPV-FIP:GAACCGCTTTGCATTCGAGCTGTCAACACAAAGCCGACATGG(SEQ ID NO: 3)
内引物ApNPV-BIP:AGCGCAAATAGAAACGCGCAAAGCAATTTGTCGTAAGCCGC(SEQ ID N0:4)。
[0012]—种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，包括以下组分:
(1)检测引物溶液:由外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP配制检测引物溶液的浓度依次为4?6 ymol/L^4-6 ymol/L^32-48 ymol/L、32?48ymol/L；
(2)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7?9UAiL;
(3)10X反应缓冲液:200mmol/LTris-HCl pH 8.8； 100 mmol/L KCl ； 100 mmol/L(NH4)2S04;40?100 mmol/LMgS04；6~14 mol/L 甜菜喊；
(4)dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
(5)显色剂:1000X SYBR GREEN I荧光染料。
[0013]优选的，所述检测引物溶液中含有5ymol/L外引物ApNPV-F3、5 ymol/L外引物ApNPV-B3、40 ymol/L内引物ApNPV-FIP、40 ymol/L内引物ApNPV-BIP。
[0014]优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8 U/yL。
[0015]优选的，所述的10X反应缓冲液中MgS04、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L,8 mol/L0
[0016]利用以上所述的试剂盒检测柞蚕核型多角体病毒的方法，包括如下步骤:
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200yL反应管内加入模板DNA2?5yL、检测引物溶液lyL、Bst DNA聚合酶lyL、10 X反应缓冲液2.5yL、dNTPs溶液2?5yL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为2 5yL;
(3)运行LAMP扩增反应:63?65°C孵育15?25min，80°C孵育5min终止反应；
(4)LAMP扩增结果鉴定:在反应管中加入I?2yL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
[0017]通过实验证明，本发明提供的柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。
【附图说明】
[0018]下面利用附图所示的实施例对本发明作进一步描述。
[0019]图1是实施例2中进行特异性检测结果图，I?8依次为感染ApNPV的柞蚕幼虫、健康柞蚕幼虫、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)、美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)、茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)、蓖麻蚕核型多角体病毒(PcNPV)、超纯水空白对照。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实例对本发明作进一步的说明。
[0021 ]本发明的一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组，包括外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP，其核苷酸序列分别为:
外引物ApNPV-F3:CGAGTCACGCGCTTTAGC(SEQ ID NO:1)
外引物ApNPV-B3:TGGCTGTCTAGCTGGTTCT(SEQ ID NO:2)
内引物ApNPV-FIP:GAACCGCTTTGCATTCGAGCTGTCAACACAAAGCCGACATGG(SEQ ID NO: 3)
内引物ApNPV-BIP:AGCGCAAATAGAAACGCGCAAAGCAATTTGTCGTAAGCCGC(SEQ ID N0:4)。
[0022]本发明的一种柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，包括以下组分:
(1)检测引物溶液:由外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP配制检测引物溶液的浓度依次为4?6 ymol/L^4-6 ymol/L^32-48 ymol/L、32?48ymol/L；
(2)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7?9UAiL;
(3)10X反应缓冲液:200mmol/LTris-HCl pH 8.8； 100 mmol/L KCl ； 100 mmol/L(NH4)2S04;40?100 mmol/LMgS04；6~14 mol/L 甜菜喊；
(4)dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
(5)显色剂:1000X SYBR GREEN I荧光染料。
[0023]优选的，所述检测引物溶液中含有5ymol/L外引物ApNPV-F3、5 ymol/L外引物ApNPV-B3、40 ymol/L内引物ApNPV-FIP、40 ymol/L内引物ApNPV-BIP。
[0024]优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8 U/yL。
[0025]优选的，所述的10X反应缓冲液中