CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及基因敲除技术领域，具体设及 CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性祀向CMAH基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002] 器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的 患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手 术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。W肾脏移植为例， 我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部 分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其 他物种，W提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。
[0003] 目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪 成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到 人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，W产生适合于人体移植 的器官，成为异种移植的终极目标。
[0004] 免疫学的研究发现猪的细胞表面表达一种糖类化合物：N-径乙酷神经氨酸 (N-Glycol}dneuraminic Acid,化u5Gc)。它的合成依赖于胞巧单憐酸-N-乙酷神经氨酸径 化酉每（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH) 〇 人类细 胞由于缺乏有功能的CMAH基因，不能合成化u5Gc。而猪细胞表面的化u5Gc进入人体后可 被人体免疫系统识别并引发免疫排斥反应。因此，需要消除猪细胞表面的Neu5Gc分子W减 少异种供体器官的免疫原性。而准确高效的敲除猪CMAH基因，是消除化u5Gc引起的免疫 排斥的关键步骤。
[0005] 目前，常见的基因敲除技术包括同源重组化omologus Recombination, HR)技术、 类转录激活效应子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技术、锋指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技术W及最近发展的规律成簇间隔短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R巧eat, CRISPR)技术。 皿技术由于重组效率低下（效率大约只有10 6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已 逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20%，但都需要构建可W识别 特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱祀 率，其应用有限。
[0006] CRISIS是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋 白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有Ξ种类型，其中第二类化s9 系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。化s9祀向切割DM是通过两种小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)与祀序列互补识别的原理实现 的。现在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，能够识别 特定的基因序列，引导化s9蛋白进行切割。在真核生物中，DM被切断后发生非同源重组 末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。
[0007] 相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的祀向切 害d。因此，通过CRISPR技术敲除CMAH基因能够极大地提高化u5Gc缺失细胞及基因工程猪 的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确祀向的sgRNA，因为基因的祀向 精确度高度依赖于sgRNA祀序列，能否成功设计出精确祀向的sgRNA成为敲除目的基因的 关键技术问题，本发明意在解决该技术问题从而为敲除CMH基因提供坚实的基础。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异 性祀向CMAH基因的SgRNA。
[0009] 根据本发明的第一方面，本发明提供在CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因中用 于特异性祀向CMH基因的SgRNA,该SgRNA具有W下特点：
[0010] (1)该SgRNA在CMAH基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列规则，其 中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的祀序列位 于正义链或反义链；
[0011] 似该SgRNA在CMAH基因上的祀序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区， 或祀序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交 界，位于相邻内含子；
[0012] (3)该SgRNA在CMAH基因上的祀序列是唯一的。
[0013] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID NO :1~61中任一条序列 所示的序列。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID NO :2或4所示的序列。
[0015] 根据本发明的第二方面，本发明提供运用CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的 方法，该方法包括如下步骤：
[0016] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列对应的互补序列的两端加 上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；将合成的正向寡核巧酸 序列与反向寡核巧酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0017] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入线性化的携带化s9基因的表达载体，得到携带含 相应祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正 确的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[001引 （3)用上述携带有SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表达载体、包装质粒和包装细 胞系包装出同时携带祀向CMAH基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0019] (4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的 细胞，W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确 定CMAH基因的敲除情况。
[0020] 作为本发明的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQ ID NO :62所示序列的载 体。
[0021] 作为本发明的优选方案，上述方法包括如下步骤：
[002引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列对应的互补序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；将合成的正向寡核巧酸序列与反向寡核巧 酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0023] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入如序列表中SEQ ID NO :62所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带SgRNA寡聚核巧 酸的重组表达载体lentiCRISPR V2-CMAH，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆， 并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0024] (3)用上述表达载体lentiCRISPR V2-CMAH、包装质粒和包装细胞系包装出同时携 带祀向CMAH基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[002引（4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染 的目的细胞，W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶 化确定CMAH基因的敲除情况。
[0026] 作为本发明的优选方案，上述包装质粒为质粒pLPl、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG ; 上述包装细胞系为肥K293T细胞。
[0027] 作为本发明的优选方案，上述目的细胞为猪PIEC细胞。
[002引作为本发明的优选方案，上述W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因 片段，经过变性、复性及酶切，确定CMAH基因的敲除情况，具体为：
[0029] (a) W感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用CMAH基因的上下游引物扩增 包含上述SgRNA的祀序列的CMAH基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细胞 的基因组DNA ;
[0030] 化）纯化上述扩增到的CMAH基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的CMAH基 因片段与来自野生型细胞的CMAH基因片段等量混合、加热变性、复性，形成杂交DNA分子；
[0031] (C)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
[003引 （d)电泳检测酶切产物，检测祀序列介导的CMAH基因敲除效果。
[0033] 根据本发明的第Ξ方面，本发明提供在CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的方 法中用到的重组表达载体lentiCRISPR V2-CMAH，该重组表达载体的骨架载体的序列如序 列表中SEQ ID NO :62所示；所携带的祀序列如第一方面的SgRNA的祀序列，优选序列表中 SEQ ID NO :2或4所示的祀序列。
[0034] 根据本发明的第四方面，本发明提供如第一方面所述的SgRNA或第Ξ方面所述的 重组表达载体lentiCRISPR V2-CMAH在CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的方法中的 用途。
[003引