融合蛋白分子和它的使用方法
【专利说明】
[0001 ]本发明要求于2013年3月15日提交的美国临时申请No. 61/802，169的优先权。本发 明也要求于2012年6月4日提交的美国临时申请No.61/655,428的优先权，现已放弃。运两个 申请均通过整体引用合并入本申请中。
技术领域
[0002] 本发明设及包含细胞因子部分和祀子导向部分的融合分子。细胞因子部分包含一 个或多个细胞因子。祀子导向部分包含一个或多个配体。每个配体是能够识别祀子(包括但 不局限于，细胞或病毒颗粒)表面受体的小肤、蛋白、或小分子。
【背景技术】
[0003] 细胞因子，例如淋己因子、趋化因子和生长因子，是由包括淋己细胞、单核细胞在 内的多种类型的细胞产生，在人类生理和疾病控制中有广泛的作用。运几种细胞因子在临 床上证明能够有效的治疗多种疾病。
[0004] 例如，白细胞介素-2(化-2)，作为一种细胞因子已经被美国食品及药物管理局 (FDA)W及世界上其它机构批准，在临床上可用于治疗转移性肾癌和恶性转移性黑色素瘤。 然而，目前市场上的IL-2的治疗窗由于存在副作用而有着一定的局限性，比如毛细血管渗 漏综合症(CLSKIL-2的作用机制是通过促进整个生理循环中T细胞的增殖而发挥作用，而 不是特异性的针对原发性和转移性肿瘤。因此，如果IL-2能够祀向作用于肿瘤细胞，那么其 治疗窗会增加。
[0005] 美国专利USRE33653E描述了一个IL-2突变体的复合物和使用方法。US4935356A描 述了在大肠杆菌中表达和纯化IL-2的方法。US8580267B2公布了一种用化疗药物结合免疫 细胞因子治疗肿瘤的方法，即由细胞因子(例如IL-2)、与肿瘤新生血管抗原结合的抗体(例 如腫糖蛋白tenascin-C)、联合治疗的化疗药物（例如替莫挫胺）的联合治疗。EP0229998B1 描述了一种融合蛋白，该蛋白至少包含IL-2的一部分（与IL-2的C端和N端的氨基酸序列基 本一致），但其不具有生物学活性，同时不包含IL-2至少前100个氨基酸。
[0006] 干扰素蛋白a(IFN-a)由白细胞产生，主要参与病毒感染引起的先天性免疫应答。 IFN-a蛋白包含 13个亚型：IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、 IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。编码运些IFN-a分子的基因成簇排列于第9号染色 体上。美国专利US7611700B2描述了具有蛋白酶抗性的修饰后的IFN-a多肤。
[0007] Lee JH等人描述了 "KISS1基因，运是一种新型的抑制人类恶性黑色素瘤转移的基 因 "（Lee JH，et al.Journal of the 化tional Cancer Institute'Vol.88(23):1731-1737(1996))。据报道，1(1551编码至少4个功能性的多肤产物:1(133969^11-54(又名转移抑 制素）、1^1339691:;[]1-14、1(1339邱1:;[]1-13、1(1339691:;[]1-10，分别含有54、14、13、10个氨基酸 (Kotani Μ et al.J.Biol.Chem.Vol.276(37):34631-34636(2001);0htaki T.et al.， 化ture Vol. 411(6837) :613-671(2001))。四种产物均含有相同的10个氨基酸，C端均为酷 胺化的氨基酸，但N端长度不同。它们是KISS1R(-个G蛋白偶联受体）的功能性配体(US 6699965 B1)dKISS1/KISS1R与包括青春期启动在内的生殖系统的发育相关(Popa SM et al.，Annu.Rev.F*hysiol .Vol 70:213-38(2008))。据报道，Kisspeptins能够抑制肿瘤细胞 的转移化ee JH and Welch DRJnt.J.Cancer.V〇1.71(6):1035-1044(1997))。转移抑制素 衍生物还具有卓越的生物学活性(例如:癌细胞转移抑制活性、癌细胞生长抑制活性等）（详 情见US 6800611 B2，US 7625869 B2，US 8361968 B2，US 8592379 B2)eUS7112662B2描述 了一个抗转移抑制素抗体及其使用方法，从而转移抑制素及其衍生物可被高度灵敏性地特 异量化。
[0008] 融合蛋白或嵌合蛋白（由不同来源的几个部分组成）是由两个或多个编码单独蛋 白的基因整合编码而产生。美国专利US8076288B2记述了融合多肤有降低血糖的活性。 US7569384B2公布了白蛋白融合蛋白。
【发明内容】
[0009] 本发明设及一个融合分子的复合物，包含一个细胞因子部分和一个祀子导向部 分。细胞因子部分由一个或多个细胞因子组成。祀子导向部分由一个或多个配体组成。每个 配体为能够识别祀标(包括但不局限于细胞或病毒颗粒等)上受体的多肤、蛋白或者的小分 子。祀子导向部分把融合分子带到祀标上，因此使细胞因子在祀位上发挥作用。从而细胞因 子的活性能够得到加强。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，细胞因子是IL-2的一部分或者一个突变体。或者趋 化因子可 W 是 GM-CSF、TNF-alpha、IFN-alpha、IFN-be 化或 IFN-gamma。
[0011] 在某些实施例中，有的融合蛋白的配体部分至少包含一个Kisspeptin的片段或突 变体。该部分把融合分子带到祀子免疫细胞上，细胞因子部分刺激免疫细胞的增殖，从而增 强了对祀子的免疫应答。
[0012] 在另一些实施例中，有的融合分子的配体部分至少包含一个内皮素-1、内皮素-2 或内皮素-3的片段或突变体，细胞因子部分包含至少一个IL-2,或TNF-alpha，或IFN-al地日，或INF-beta，或INF-gamma的片段或突变体。
[0013] 本发明还公布了用细胞因子-配体融合蛋白治疗人类疾病的方法。在某些方面，引 起转移性肾癌或转移性黑色素瘤等人类癌症的肿瘤细胞是祀点。另外，病毒感染的细胞及 病毒颗粒也是祀点。细胞因子-配体融合蛋白用来治疗某种或者多种由病毒感染引起的疾 病。
[0014] 在接下来的细述及附件的声明中会进一步掲示本发明的其他方面和优点。上述所 提及的实施例的一个、多个或所有特点可能会结合到本发明中形成新的内容。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明中一个细胞因子-配体融合分子案例的原理图。
【具体实施方式】
[0016] 本发明设及包含一个功能部分和祀点导向部分的融合分子。功能部分包含一个或 多个细胞因子。祀点导向部分包含一个或多个表达或附着在祀细胞上的受体所对应的配 体。配体是一个多肤、蛋白或者小分子。祀点包括肿瘤细胞、病毒感染的细胞或病毒颗粒等。 配体-细胞因子融合蛋白增强了免疫应答。祀点导向部分使融合蛋白在祀细胞位点处聚集， 功能部分在祀位点处发挥作用，从而提高了融合蛋白抗祀细胞的活性。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，细胞因子至少是W下白介素的一部分或者是白介素 突变体：IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、GM-CSF、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31 (+non IL 0SM、LIF、CNTFCTF1)、IL12、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL：M、IL10/IL22、 IL19、IL20、IL24、IL26、IL28A、IL28B、IL29、ILlA、ILlB/ILlF2、lRa/ILlF3、ILlF5、ILlF6、 比1尸7、比1尸8、比1尸9、比1尸10、比1尸11、比16、比174、比178和比25。
[0018] 在另一种实施方式中，上述IL-2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
[0019] APTSSST邸TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEEVLNLAQSKN FHLRP畑LISNINVIVLELKG沈TTFMCEYADETATIVEFLNR W口FCQSIISTLT(SEQ ID N0:1).
[0020] 在另一种实施方式中，细胞因子包含至少一个TNF家族的因子，上述TNF家族包括 TNFA/TNFSF2、Lymphotoxin(TNFB/LTA，TNFC/LTB)、TNFSF4、TNFSF5/CD40LG、TNFSF6、 TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSFl 0、TNFSFl 1、TNFSFl 3B 及 EDA。
[0021] 在另一种实施方式中，上述TNFA包含至少下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
[0022] VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGV 化畑 NQLVVP 沈化化 IYSQ 化 FKGQGCPSTHV1XT HTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGD化SAEINRPDYLDFAESGQVYFGI IAL(沈Q ID N0:3).
[0023] 在另一种实施方式中，细胞因子至少包含干扰素的一部分或干扰素突变体，上述 干扰素包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、 IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1和IFNG。
[0024] 在本发明的另一种实施方式中，上述IFNA1至少包含下列氨基酸序列的一部分或 其突变体。
[0025] MASPFALLMVLWLSCKSSCSLGCDL 阳 THSLDNRRTLMLLAQMSRISPSS 化 MD 畑 DFGFPQ 邸抑 GNQFQKAPAI SVLHELIQQIFNLFTT邸SSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRR口LYL TEKKYSPCAWEVVRAEIMR化化S?L犯RLR服E(沈Q ID N0:5).
[00%]在另一种实施方式中，上述IFNA2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
[0027] MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQM 服 ISLFS 化邸畑 DFGFPQ 邸 FGNQFQKAETIP VLHEMIQQIFNLFST邸SSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMK邸SILAVRKYFQRITLYLK EKKYSPCAWEVVRAEIMRSF化S?L犯SLRSKE(沈Q ID N0:6).
[0028] 在另一种实施方式中，上述IFNBl至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
[0029] MTNK 化 LQIA 化 LCFSTTALSMSYNLLG 化 QRSSNFQCQKLLWQLNGRLEY 化邸 RMN抑 I 阳 EIKQLQQFQKEDAA LTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGW肥TIVE化LANVYHQINHLKTVLE邸LEK邸FTRGKLMSSLHLKRYYGRIL肌L KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:7).
[0030] 在另一种实施方式中，上述IFNG至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
[0031] MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESD服IMQSQIVSFYF KLFKNF 邸 DQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNK 邸畑 DF 邸 LTNYSVTDLNVQ 服 AI 肥 LIQVMAELSPAAKTGK 服 R SQMLFRGRRASQ(SEQ ID NO:8).
[0032] 在另一种实施方式中，上述内皮素-3至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变 体。CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(沈Q ID N0:9)
[0033] 在另一种实施方式中，细胞因子至少包含W下一个趋化因子:(XL1、CCL2/MCP-1、 CCL3/MIP-la、CCL4/MIP-10、CCL5/RANTES、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLll、CCL12、CCL13、 (XL14、(XL15、(XL16、(XL17、(XL18、(XL19、(XL20、(XL21、(XL22、(XL23、(XL24、(XL25、 (XL26、(XL27、(XL28、CXCL1 /KC、CX化2、CX化3、CX化4、CX化日、CX化日、CX化7、CX化8/1L8、 CX化9、CX化10、CX化11、CX化12、CX化13、CX化14、CX化1日、CX化1日、CXCL17、CX3CL1、X化1和 ax2。
[0034] 在另一种实施方式中，有的细胞因子至少包含W下一个趋化因子:KITLG、CSF和 SPP1。
[0035] 在另一种实施方式中，趋化因子为GM-CSF，或TNF-alpha，或IFN-alpha，或FN-beta，或IFN-邑amma。
[0036] 在另一种实施方式中，有的细胞因子至少包含生长因子的一个片段或者突变体， 生长因子选自包含肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌移动因子、骨形态发生蛋 白（BMPs)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子化GF)、红细胞生成素化P0)、纤维母 细胞生长因子(FGF)、神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨隧细胞集落刺 激因子（GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子（HGF)、肝癌衍生生长因子 (皿GF)、膜岛素样生长因子（IGF)、促移行因子；肌生成抑制蛋白（GDF-8、神经生长因子 (NGF)和其他神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TP0)、转变生长因 子α(TGF-a)、转变生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、血管内皮生长因子(VEGF)、 Wnt信号通路、胎盘生长因子(P1G巧。
[0037] 在另一种实施方式中，有的配体部分至少包含内皮素-1、内皮素-2或内皮素-3的 一部分或其突变体，细胞因子部分至少包含比-2，或TNF-alpha，或IFN-al地a，或INF-beta， 或INF-gamma的一部分或其突变体。
[0038] 在另一种实施方式中，有的配体包含能结合一个或多个受体的肤段或蛋白的一部 分或其突变体，运些受体包括:在肝炎病毒化AV，或皿V，或HCV)感染之前或之后，表达在肝 细胞表面的受体、乙型肝炎病毒表面抗原化BVsAg)、人体免疫缺损病毒甜120 WIV)、人体免 疫缺损病毒gp4UHIV)、或人类流感病毒的血凝素、SARS冠状病毒膜粒蛋白E2、SARS冠状病 毒纤突蛋白、SARS冠状病毒血球凝集素醋酶糖蛋白。