尿液中的hpv检测的制作方法
【专利说明】尿液中的HPV检测
[0001] 本公开内容领域
[0002] 本公开内容设及基于分子技术的医学和临床诊断的领域。该技术包括用于检测来 自人受试者的尿液样品中人乳头瘤病毒化PV)核酸分子作为受试者中HPV感染的指示物的 方法。该检测方法包括HPV感染的类型特异性检测和HPV基因型的检测。
[0003] 本公开内容的背景
[0004] 就在最近的2011年，通过使用尿液样品的人乳头瘤病毒化PV)感染的检测包括了 对可溶性PCR抑制剂在尿液中存在的关注(参见Bissett等的第1745页右栏）。该关注导致 Bissett等测试了 Ξ种不同的用于处理尿液样品的方案作为HPV核酸提取的一部分。被报道 为在Ξ种当中具有较好的灵敏度的一个方案是，Wl3,000rpm离屯、尿液（lml)20分钟，去除 所得的上清液，在30化1中重悬，然后在-25°C冷冻直到用于核酸提取。其他两种方案是，在-25°C储存未处理的尿液，随着i)在解冻之后离屯、和重悬（并然后立即用于核酸提取）；W及 ii)在解冻之后不处理(并直接用于核酸提取）。
[000引相比于未分级的尿液，Bissett等报道的细胞团块(cellular pel let)中的较高灵 敏度与多名研究人员如Vorsters等在2012年W及Enerly等在2013年综述的使用细胞团块 一致。Vorsters等指出的两个例外是，Strauss等，其等报道了通过离屯、为上清液和重悬在 较小体积上清液中的细胞团块对尿液分级，W及Smits等，其报道了如由Boom等所描述的通 过硫氯酸脈(guanidinium thiocianate)裂解和分离来提取男性尿液。使用稀释减少或消 除PCR抑制剂的影响被Strauss等明确指出（参见第538页；LStrauss等还报道了通过浓缩细 胞团块通过用尿液上清液重悬形成的级分(fraction)中58.4%的峰值灵敏度(参见第540 页)。
[0006] 本文对文献的引用不应被解释为反映对任一文献是相关的现有技术的承认。此 夕h它们的引用不指示对相关公开内容的检索。关于运些文献的日期或内容的所有叙述基 于可获得的信息而不是对其准确性或正确性的承认。
[0007] 本公开内容简述
[0008] 本公开内容设及用于检测来自人受试者的尿液样品中的人乳头瘤病毒化PV)核酸 分子的方法。所公开的方法不将尿液分级为无细胞级分和含细胞级分，或可溶性级分和不 溶性级分，并且令人惊讶地提供了比对于细胞团块报道的灵敏度更高的灵敏度。不分级允 许从尿液制备核酸而不产生因分离技术导致的分子损失。甚至在制备和检测HPV核酸之前 解冻的冷冻样品的情况下观察到来自未分级的尿液的令人惊讶的灵敏度。
[0009] 在第一方面，本公开内容包括通过使用来自人受试者的尿液样品检测人乳头瘤病 毒化PV)感染的方法。样品可来自女性或男性受试者，任选地调整所述检测W适应所观察到 的HPV感染的类型或者本领域技术人员已知的针对女性受试者或男性受试者的HPV感染的 类型。
[0010] 所公开的方法包括从收集自人受试者的尿液样品中分离或制备核酸。尿液样品在 分离或制备之前是未分级的。因此，不存在将尿液样品处理为含细胞级分和无细胞级分，或 可溶性级分和不溶性级分。且尿液样品包含如人类受试者的尿液中存在的无细胞HPV核酸、 HPV病毒粒子或病毒颗粒，W及细胞缔合的HPV核酸。
[0011] 在一些实施方案中，尿液样品被处理W减少核酸降解。处理可在收集之后且在样 品被进一步处理、操作或储存之前。在其他实施方案中，处理可在收集W及进一步处理、操 作或储存之后但在提取、分离或制备样品中的核酸分子之前。处理的非限制性实例包括冷 冻样品、降低样品的溫度、热灭活样品中的核酸酶、增加 pH、添加减少降解的试剂，或本领域 技术人员已知的运些技术的组合。在某些情况下，所添加的试剂增加 pH、增加盐浓度或离子 强度;或者所添加的试剂是乙二胺四乙酸化DTA)，盐酸脈异硫氯酸脈(G 口 C)或其他离液盐， N-月桂酷肌氨酸，W及十二烷基硫酸钢。如本文描述的任何处理产生被处理的尿液样品，从 该被处理的尿液样品可如下所述地制备核酸。
[0012] HPV核酸的分离或制备在外源或添加的核酸载体试剂的存在下来进行。载体试剂 可W是技术人员已知的用于改进核酸的分离而不干扰随后的分离步骤的任何载体试剂。非 限制性实例包括载体RNA、载体DNA、线性聚丙締酷胺(LPA)和糖原。
[0013] 分离的HPV核酸可通过技术人员已知的手段来检测。在一些实施方案中，检测可包 括一个或更多个HPV序列的扩增。在一些情况下，扩增可包括使用正向和反向引物的聚合酶 链式反应(PCR)。引物之一或二者可包括非HPV序列和/或可检测的标记。在其他实施方案 中，检测可包括扩增，随后是对所扩增的分子测序。在另外的实施方案中，检测可包括直接 测序核酸而无需事先扩增。在另外的可选实施方案中，检测包括选自作为非限制性实例的 W下技术:核酸杂交;循环探针反应;单链构象多态性(SSCP);链置换扩增(STA);W及限制 性片段长度多态性(RFLP)。
[0014] 检测到尿液样品中的HPV核酸序列指示HPV核酸分子在样品的尿液来源中的存在。 核酸分子可呈W下形式:无细胞核酸、HPV病毒粒子或HPV病毒颗粒、细胞缔合的核酸，诸如 细胞内的HPV核酸分子或与细胞的外表面缔合的HPV核酸分子，或W上的任何组合。在细胞 内的HPV核酸分子的一个非限制性实例是在细胞内的一个或更多个游离(episomal)拷贝的 HPV基因材料。另外，检测到尿液样品中的HPV核酸分子指示HPV感染在受试者中的存在。在 一些实施方案中，感染可W是对于泌尿道中的细胞的。在其他实施方案中，感染可W是对于 来自泌尿道外的细胞的，作为非限制性的实例诸如宫颈细胞。
[001引被检测的HPV可W是单一类型的，作为非限制性的实例诸如HPV16或18。可选地，检 测可W是两种或更多种类型的，诸如HPV 16和18,或HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59和68。在一些情况下，检测可W是至少一个"高风险"的HPV类型和至少一个"低风险" 的HPV类型的。因此，检测包括检测任何一种或更多种HPV类型。
[0016] 在一些实施方案中，方法可W包括(a)从自人受试者收集的未分级的尿液样品中 并在外源或添加的核酸载体试剂的存在下，从所述样品分离HPV核酸，W及(b)检测所分离 的HPV核酸。在一些情况下，检测的HPV核酸的存在可用来指示HPV感染在受试者中的存在。 分离可包括去除非核酸或非DNA细胞组分，诸如不与核酸缔合的蛋白和脂质。
[0017] 在第二方面，本公开内容包括了制备存在于来自人受试者的尿液样品中的HPV核 酸的方法。所公开的方法可包括按本文描述的从收集自人受试者的未分级的尿液样品分离 或制备核酸。所得核酸可技术人员已知的任何适合的方式被测定、测试或使用。所得的 核酸是如存在于人类受试者的尿液中的无细胞HPV核酸、来自HPV病毒粒子或病毒颗粒，或 来自细胞缔合的HPV核酸。如本文所述的，尿液样品任选地被处理W减少核酸降解。另外，如 本文描述的，HPV核酸的分离或制备在外源或添加的核酸载体试剂的存在下来进行。
[0018] 在一些实施方案中，方法可W包括从自人受试者收集的未分级的尿液样品中并在 外源或添加的核酸载体试剂的存在下，分离所述样品中的核酸。分离可包括去除非核酸或 非DNA细胞组分，作为非限制性的实例诸如蛋白和脂质(且包括不与核酸缔合的那些）。所得 的分离的材料是包括HPV核酸分子和非HPV核酸分子(诸如来自受试者的细胞基因组的那 些)两者的组合物。分离的HPV核酸可W是单一类型的，作为非限制性的实例诸如HPV 16或 18。可选地，核酸可W是两种或更多种类型的，诸如HPV16和18,或HPV 16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59和68。在一些情况下，核酸可^是至少一个"高风险"的册￥类型和至少 一个"低风险"的HPV类型的。
[0019] 在另外的方面，本公开内容包括运样的组合物，其包含通过所公开的方法分离或 制备的HPV核酸。所述组合物包含减少的量的蛋白质W及最初与HPV核酸一起存在于尿液样 品中的其他生物组分或细胞组分。减少蛋白质W及其他生物组分或细胞组分可通过本文描 述的任何方法。所述组合物可包含与适合的缓冲剂和/或馨合剂组合的核酸。
[0020] 本公开内容还提供了用于检测HPV的诊断试剂盒，所述试剂盒包括:进行全部或部 分本文公开的方法的试剂。
[0021 ] 附图简述
[0022] 图1示出了来自感染了 HPV-16(上图）和HPV-54(下图）的人受试者的尿液样品的毛 细管电泳分析的代表性结果。所指示的碱基对(〇、20、40、60、80、100和120)反映了使用如本 文公开的一组高风险化R)引物的PCR反应检测到的核酸分子的长度。深色踪迹是样品踪迹， 而深色踪迹是分子量标志物。Y轴刻度指示从0至10,000的相对巧光单位。
[0023] 图2示出了来自未感染的（阴性对照）人受试者和分别感染了HPV-16、HPV-18和 HPV-81的人受试者的尿液样品的毛细管电泳分析的代表性结果。所指示的碱基对(0、20、 40、60、80、100和120)反映了通过使用与图1中相同的高风险化3)引物的?〔巧广增检测到的 HPV分子的长度。阴影区域指示93-9化P的范围。Y轴刻度指示从0至10,000的相对巧光单位。
[0024] 实践本公开内容的方式的详述
[0025] 遮述
[0026] 人乳头瘤病毒化PV)是与皮肤和粘膜上皮的良性和恶性病变相关的亲上皮细胞病 毒(邱itheliotropic viruses)。存在对HPV感染与宫颈癌的后续发展之间的因果关系的充 分证实。还存在将HPV感染与头部和颈部、呼吸组织和乳腺的癌症相关的观察结果。 (Braakhuis等，2004 , J.化tl. Cancer Inst. 96(13): 998-1006 ; Dahlstrand等，2004 , Anticancer Res.24(3b): 1829-35;Daling等，2004,(Mincer 101(2) :270-80;Ha等，2004, Grit.Rev.Oral Biol.Med.15(4):188-96;化fkam