Hphd1蛋白或其编码基因在调控植物耐碱性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及HPHD1蛋白或其编码基因在调控植物耐碱性 中的应用。
【背景技术】
[0002] pH是衡量氢离子浓度的指标。对于植物而言，由于生长在土壤中，要从土壤中直接 吸收水分和养料，所以根系的pH环境会直接对植物造成影响；同时跨膜质子浓度梯度亦是 细胞与周围环境进行物质能量交换的动力。外界pH变化会影响细胞内的pH，同样细胞内的 生理活动也会影响根系的环境pH。细胞液泡通常维持在一个酸性环境，pH值在4. 5到5. 5 之间，而细胞质pH维持在7. 5左右。这样的一种pH动态平衡机制对维持细胞的正常生命 活动是必需的。当遇到环境胁迫时或者生长发育的特定时期，细胞质pH会降低或者升高来 做出适应，但是这样的pH改变会很快得到恢复。
[0003] 植物细胞质膜内外由质子形成的电化学梯度，通过质膜上的质子ATP酶，植物细 胞水解ATP，将化学能转化为跨膜的pH梯度。这种跨膜的电化学梯度可以驱动跨膜的物质 运输。在拟南芥中，研究表明质膜上的质子ATP酶参与了细胞间的pH调控以及环境pH的 改变。
[0004] 据报道，目前我国存在盐碱化的土地面积几乎与我国可耕地面积相当，每年造成 经济损失不可估量，并且盐碱化土地每年还在以很高的速度增加，每年会有大量土地因为 耕作不善而退化为不适宜作物生长的盐碱地。如何改良作物，使农作物可以耐受盐碱地并 且不影响作物的产量和品质，成为了亟待解决的问题。为了 了解植物抵抗碱胁迫的机制，我 们在模式植物拟南芥中设计了如下系统：通过构建T-DNA插入突变体库，筛选与pH相关的 突变体，研究植物适应环境pH变化的机理，以期找到有效的方法改良作物，达到使作物可 以耐受碱化土壤的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供HPHD1蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载 体的新用途。
[0006] 本发明提供的HPHD1蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植 物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围；
[0007] 所述HPHD1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0008] 上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；
[0009] 所述耐逆性为耐碱性，所述耐碱性具体为碱性pH值的耐逆性。
[0010] 上述应用中，所述HPHD1蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0011] 上述应用中，所述重组载体为将所述HPHD1蛋白编码基因插入表达载体得到的重 组载体。在本发明的实施例中，表达载体为PCAMBIA1300,重组载体pCAMBIA1300-HPHDl为 将序列表中序列1所示的HPHD1基因其插入pCAMBIA1300载体（Cambia VZC0323)的BamHI 酶切位点间，得到重组质粒。
[0012] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南 芥；
[0013] 所述碱性pH值为8.0。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性转基因植物的方法。
[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将HPHD1蛋白编码基因导入目的植物中，得到 转基因植物；所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物；
[0016] 所述耐逆性为耐碱性，所述耐碱性具体为碱性pH值的耐逆性。
[0017] 所述HPHD1蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中序列1。
[0018] 上述方法中，所述HPHD1蛋白编码基因通过重组载体导入目的植物；
[0019] 所述重组载体为将所述HPHD1蛋白编码基因插入表达载体得到的重组载体。
[0020] 上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为 拟南芥，所述拟南芥具体为hphdl突变体。
[0021] hphdl突变体种子于2014年09月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮编100101)，保藏号061〇：吣.9599，分类命名为拟南芥（4抑1^(1(^8丨 8也31丨3仙）。
[0022] 本发明的实验证明，将HPHD1基因互补到hphdl突变体中得到的转基因植物，该转 基因植物的表型与未突变前的野生型拟南芥无显著差异，从而证明，HPHD1基因可以提高植 物对碱性pH值的耐逆性，
【附图说明】
[0023] 图1为Col-Ο野生型拟南芥和hphdl突变体在不同pH胁迫下的表型分析
[0024] 图2为HPHD1基因在hphdl突变体中的定位
[0025] 图3为hphdl突变体和互补后的转基因植物在不同pH胁迫下的表型分析
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 下述实施例中，除特殊说明外，定量试验均设5个以上的重复实验。
[0029] 实施例1、HPHD1基因在提高植物耐碱性中的应用
[0030] 一、筛选T-DNA插入突变体库获得hphdl突变体
[0031] 以野生型Col-Ο拟南芥为材料，构建T-DNA(pSKI015)插入突变体库，获得约5000 个突变体株系，用PH8. 0MS筛选生长缺陷的植株，获得hphdl突变体。
[0032] 在拟南芥3号染色体发现了基因组序列的突变位点，最终测序结果表明这个位点 位于AT3G54360的第5外显子上，具体为16bp的缺失导致提前形成一个终止密码子，如图 2所示。AT3G54360编码一个具有405个氨基酸的蛋白质，含有1218个碱基7个外显子，将 该基因名为HPHD1 (High-pH defective)，其核苷酸序列为序列表中序列1，编码的蛋白命名 为HPHD1，其氨基酸序列为序列表中序列2。HPHD1在进化上非常保守，从酵母到植物中都发 现存在，但动物体内没有。hphdl突变体种子的保藏编号为CGMCC No. 9599。
[0033] hphdl突变体种子于2014年09月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮编100101)，保藏号061〇：吣.9599，分类命名为拟南芥（4抑1^(1(^8丨 8也31丨3仙）。
[0034] 二、HPHD1基因在植物碱性pH值耐逆性中的应用
[0035] 将hphdl突变体（hphdl)和野生型拟南芥Col-0 (Col-Ο)在普通MS培养基上生长 5天后分别转移到不同pH值（pH值