稻瘟病抗性相关基因OsCOL9的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种水稻抗病基因的应用，具体涉及一 种稻瘟病抗性相关基因0SC0L9的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻(Oryza Sativa)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的人口 (Khush，2005)，也是我国近一半人口的主要食物来源（刘国权等，2004)。由稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻痕病，是水稻生产上的重要限制因素 （Liu et al， 2013)，它具有传播速度快、发生范围广、危害严重等特点。流行年份，稻瘟病重病区一般造 成水稻减产10%~20%，有时达40%~50%，局部田块甚至颗粒无收，严重威胁着水稻的生 产(Pennisi，2010)。聚合多个主效抗病基因培育水稻新品种是目前防治稻瘟病最为经济有 效的手段(雷财林等，2004)。在长期与稻瘟病共同进化的过程中，水稻演化出许多针对不同 稻瘟病菌生理小种的抗病基因，通过遗传鉴定已报道了68个位点约83个基因，其中绝大多 数基因都编码含有核苷酸结合位点与富亮氨酸重复序列的蛋白（Liu et al ,2013)。受稻瘟 病菌侵染后，水稻会通过 PTI(PAMP trigger immunity)与 ETI(effector trigger immunity)两个途径实现免疫反应。PTI主要是受病原菌关联分子模式(PAMP)诱发的免疫反 应，真菌细胞壁的几丁质，细菌外层的肽聚糖、鞭毛蛋白等小分子物质都能够激活水稻细胞 膜受体蛋白从而诱发初级免疫系统ΡΤΚΕΤΙ由病原菌释放的效应蛋白触发细胞内环境免疫 反应，ΕΤΙ发生后植物会出现R0S爆发、释放植保素、形成组织局部坏死等多种反应，该途径 是植物最主要的免疫形式（Jabs et al，1997;Friedman and Baker，2007;Dangl and Jones,2001) 〇
[0003] 不论PTI还是ETI途径，转录因子都参与了抗病信号传导，如Xa21是PAMP的病程识 别蛋白，通过与AvrXa21相互作用介导白叶枯抗性，Xa21在体内剪切释放胞内激酶，该结构 域与锌指蛋白转录因子WRKY62发生互作产生抗病反应。Pbl编码NBS-LRR类蛋白，且具有持 久的抗穗颈瘟特性，Pbl与WRKY45互作，使水杨酸表达量升高，Pbl所介导的抗病通路必须有 WRKY45的参与，该免疫反应主要在ETI水平上进行调节。转录因子的类型也非常丰富，包括 锌指蛋白、同源异性结构域、亮氨酸拉链、MYB等多个家族。这类转录因子在调控植物感受昼 夜节律变化及开花过程中发挥着重要作用，已有研究表明香蕉MaCOLl参与调控植物响应生 物及非生物胁迫反应，但C0、C0L类蛋白是否参与调控稻瘟病抗性的有关研究未见报道。
[0004] 鉴定抗病相关基因有助于深入揭示水稻的抗病机理及水稻与病原菌的具体互作 机制，进一步的选育或者培育相关的抗病品种，可以更好的更好地控制和降低稻瘟病菌对 水稻的危害，增强植物的抗病性。这些研究对水稻基因功能研究及抗病水稻育种都具有重 要的应用价值。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种稻瘟病抗性相关基 因 Os⑶L9的应用。该基因属于COL家族转录因子，受稻瘟病菌诱导后表达量增加。该基因过 量表达可以显著提高水稻稻瘟病抗性。可以利用本发明基因构建水稻过表达载体，应用于 提高水稻的稻瘟病抗性。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 本发明提供一种稻瘟病抗性相关基因0SC0L9在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。 [0008]本发明提供一种稻瘟病抗性相关基因〇sCOL9在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
[0009] 本发明在稻瘟病菌接种后水稻的差异转录组学分析发现了一个可被稻瘟病菌显 著诱导的基因0sC0L9,该基因编码蛋白含有保守的gCT/B互ox gnic finger Transcription Factor结构域，属于C0(C0NSTANS)、C0L(C0NSTANS-like)家族的成员。
[0010] 本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个提高水稻稻瘟病抗性的新基 因0sC0L9,该基因位于3号染色体上，基因座位号为L0C_0s03g50310(MSU登录号），其全长基 因组序列为2759bp(SEQ ID N0:1)括5'非翻译区（51TRK2个外显子、1个内含子和3'非翻 译区（3'UTR)(图1)。其cDNA全长1266bp(SEQ ID N0:2)，编码421个氨基酸。0sC0L9编码的蛋 白质序列如SEQIDN0:3所示，存在有CCT/BBox结构域。
[0011]本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片 段的引物。
[0012] 本发明稻瘟病抗性相关基因0sC0L9的应用，该基因受稻瘟病病原菌诱导后表达量 增加。该基因受水稻稻瘟病菌的诱导后上调表达，过量表达能明显提高水稻稻瘟病的抗性。
[0013] 将Os⑶L9与Ubi启动子构建植物过表达载体转化水稻，结果该基因过量表达可以 显著提高稻瘟病抗性。可以利用本发明基因构建成表达载体，应用于水稻抗稻瘟病育种中。
[0014] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0015]本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含CCT/B BOX结构域蛋白 的基因0sC0L9,证实0sC0L9参与了水稻对稻瘟病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗 病性的基因。本发明有助于更好地了解0sC0L9的作用机制，0sC0L9的克隆为进一步了解水 稻-稻瘟病菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1是0s⑶L9全长基因组结构示意图；其中，黑色区域为外显子，空白长方格区域 为5'非翻译区与3'非翻译区。
[0017] 图2是0s⑶L9与其它⑶L家族蛋白氨基酸序列相似性比较;其中，黑色背景区域为 保守的结构域ΒΒ0Χ与CCT。
[0018] 图3是0sC0L9在抗病材料中的表达受到稻瘟病菌的诱导的结果图。
[0019] 图4是p0X-0sC0L9过量表达载体的构建;其中，泳道Μ为lkb DNA Marker，泳道1~4 为过量表达载体P〇X_〇sCOL9酶切(KpnI/BamHI)鉴定结果。
[0020] 图5是接种稻瘟病菌8d后P0X-0SC0L9转化植株的病情调查;其中，中二软占为未转 化植株;P〇X-〇sCOL9为0sC0L9过表达转化株。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0022] 本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直 接获得，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。
[0023] 所述的中二软占在文献"优质高产水稻新品种中二软占[J].广东农业科学，2001， (〇6) :49·" 中公开。
[0024] 所述的水稻高抗稻瘟病株系H4在文献"水稻抗稻瘟病蛋白Pik2_H4基因的克隆及 互作蛋白的筛选[J].广东农业科学，2014,（04): 156-160."中公开。
[0025] 所述的稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193在文献"3个空间诱变水稻品系的 稻瘟病抗性评价及抗性遗传分析[J].华南农业大学学报，2012，33(03): 273-276中公开。 [0026]所述的过量表达载体pOX在文献"水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析[D].华 南农业大学，2012"中公开。
[0027]实施例1水稻0sC0L9基因的克隆以及序列分析 [0028] 1)水稻总RNA的提取
[0029]取中二软占（Zhongerruanzhan)(在文献"优质高产水稻新品种中二软占[J].中国 农业科学，2001，（06):49."中公开)及其水稻高抗稻瘟病株系H4(近等基因系H4)(在文献 "水稻抗稻瘟病蛋白Pik 2_H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学，2014,（04): 156-160中公开)四叶期水稻幼苗，在陶瓷研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，转入1.5mL离 心管，并按照每l〇